杨柳青 陈菁双 章勤

浙江中医药大学附属杭州市中医院 杭州 310007

过去的几十年中，卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）发病率从19%上升到26%，是导致不孕和辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）失败的主要原因[1]。高龄是导致DOR的主要因素，随着社会经济的发展、职业压力的增大，高龄妊娠已成全球普遍现象[2-3]。高龄DOR患者，在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）中不仅面临获卵数少、优质胚胎数少、低活产率等问题，同时存在胚胎质量差、胚胎非整倍体率升高等风险[4]。卵子以及受精后胚胎的数量和质量是IVF最重要的预后影响因素，因此改善高龄DOR患者卵巢生殖和内分泌功能，获得适量、高质量的卵子是IVF-ET成功的关键，也是突破IVF-ET低妊娠率和低活产率瓶颈的关键所在。

目前，DOR的西医治疗包括脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、雌激素、生长激素等，但效果欠理想[5-6]。近年来，有研究者提出卵母细胞线粒体补充和间充质干细胞有望治疗DOR，但目前仅限于动物模型研究，很少有临床报道，缺乏系统的临床研究，因而无法提供足够大的样本来证实治疗的安全性和有效性[7-8]。

何氏养巢方源于何氏妇科祖传经验方育麟方，是何氏妇科五代名中医临床经验的结晶，多年临床应用及研究表明其具有改善卵巢功能和助孕的作用[9-12]。本研究通过观察入组患者激素水平、获卵数、早期胚胎体外发育等情况，就何氏养巢方对高龄DOR患者的卵巢功能及IVF中的作用开展进一步的临床研究。

1 对象和方法

1.1 患者来源 选择2019年1月至2020年8月于浙江中医药大学附属杭州市中医院中医妇科门诊就诊，拟于浙江大学医学院附属邵逸夫医院生殖中心行IVF的患者。本研究已通过浙江中医药大学附属杭州市中医院医学伦理委员会审查（伦理审批号：2019SQ033）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照2015年美国生殖医学会（American Society of Reproductive Medicine）颁布的《卵巢功能检测及其含义解释的专家共识》[13]和第9版《妇产科学》，并结合2011年欧洲人类生殖与胚胎学学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）颁布的博洛尼亚共识制定本临床研究高龄DOR的诊断标准[14]：（1）年龄≥35岁；（2）窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）＜5～7个；（3）抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）＜0.5～1.1ng·mL-1（＜3.6～7.9nmol·L-1）；（4）基础促卵泡生成素/黄体生成素 （follicle stimulating hormone/luteinizing hormone，FSH/LH）值＜3。 具备（1）以及（2）～（4）中的任意1项。

1.2.2 中医肾虚证辨证标准 参考《中药新药临床研究指导原则》[15]和张玉珍[16]主编的《中医妇科学》，拟定肾虚证辨证标准：（1）腰膝酸软；（2）性欲减退；（3）畏寒肢冷；（4）夜尿频多；（5）口干咽燥；（6）头晕耳鸣；（7）潮热盗汗；（8）阴中干涩；（9）舌脉：舌淡或红，脉沉或细数。 （1）～（8）具备≥3项，结合舌脉即可做出诊断。

1.2.3 纳入标准 （1）符合高龄DOR及中医肾虚证诊断标准；（2）有规律的自发性月经周期，为21～35d；（3）治疗前3个月未使用过激素类药物，包括性激素及糖皮质激素类；（4）采用高孕激素状态下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS） 方案促排；（5）愿意遵守、配合诊疗方案，并签署知情同意书。

1.2.4 排除标准 （1）体质量指数（body mass index，BMI）＞35kg·m-2的女性；（2）参照《人类辅助生殖技术配置规划指导原则（2015版）》[17]，不符合IVF-ET入选标准；（3）入组前接受辅助生殖的控制性促排卵周期（controlled ovarian stimulation，COS）＞3次；（4）合并糖尿病、先天性肾上腺皮质增生、甲状腺疾病、高泌乳素血症等内分泌疾病者和精神病者；（5）已知对中药及DHEA过敏者；（6）配偶因素导致的不孕，如：重度少弱精。

1.2.5 剔除、脱落标准 （1）依从性差，不遵守约定的治疗方案者；（2）失访者；（3）中途改变促排方案者；（4）用药过程中发生不良反应，需进一步处理，不宜继续当前治疗方案者。用药过程中，患者自然受孕，则终止本次试验。

1.3 方法

1.3.1 临床分组 按随机数字表法将60例患者分为治疗组和对照组，每组30例。

1.3.2 治疗方案

1.3.2.1 治疗组 予何氏养巢方口服，1剂/d，早晚各1次，从入组后第1个月经周期开始用药，连续服用3个月经周期。何氏养巢方组成：天冬10g，葛根20g，当归10g，白芍10g，柏子仁10g，菟丝子10g，肉苁蓉10g，覆盆子10g，以上中药均来源于浙江中医药大学附属杭州市中医院中药房。

1.3.2.2 对照组 口服DHEA（商品名：顺珈侬，产地：中国香港，规格：60粒/瓶，批号：DN165152），3次/d，1粒/次。从入组后第1个月经周期开始用药，连续服用3个月经周期。

1.3.3 促排卵方案 两组均采用PPOS方案。月经周期的第2～4天起开始服用黄体酮软胶囊（商品名：安琪坦，产地：西班牙Cyndea Pharma S.L药厂，规格：0.1g/粒，批号：H20160265）0.2g/d；同时予注射用尿促性素针（商品名：乐宝得，产地：丽珠集团丽珠制药厂，规格：75U/支， 批号：H10940097）150～225U/d肌肉注射；至扳机日，予以注射用绒促性素针（商品名：注射用绒促性素，产地：丽珠集团丽珠制药厂，规格：2 000U/支， 批号：H44020673）2 000U及醋酸曲普瑞林注射液（商品名：达必佳，产地：德国辉凌制药，规格：0.1mg/支，批号：H20100365）0.1mg肌肉注射。 注射后35～36h取卵，然后行常规IVF。

1.4 观察指标

1.4.1 一般资料 年龄、身高、体质量、BMI、流产次数、不孕年限等。

1.4.2 卵巢储备功能相关指标 AMH水平、AFC数量、基础FSH、LH水平及FSH/LH。

1.4.3 卵母细胞数量、质量及发育潜能指标 （1）获卵数、成熟卵率：成熟卵率（%）=成熟卵数/获卵数×100%；（2）受精数、受精率：受精率（%）=两原核卵子数/成熟卵数×100%；（3）卵裂胚胎数、卵裂率：卵裂率（%）=卵裂胚胎数/两原核卵子数×100%；（4）可利用胚胎数、可利用胚胎率：可利用胚胎率（%）=可利用胚胎数/卵裂胚胎数×100%；（5）优质胚胎数、优质胚胎率：优质胚胎率（%）=优质胚胎数/卵裂胚胎数×100%。

1.4.4 其他指标 促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量及时间、周期取消率；肾虚证中医证候评分；治疗前后生命体征、血常规、尿常规、肝肾功能、心电图，即安全性指标。

1.5 统计学分析 应用GraphPad Prism 8.0.0软件及SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，如果数据服从正态分布或近似正态分布，组间比较采用t检验；如果数据不服从正态分布，组内比较采用Wilcoxon秩检验，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以百分比或率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例纳入情况 治疗过程中，治疗组自然妊娠1例，无脱落；对照组脱落1例。

2.2 两组患者基线资料比较 两组患者的基线比较如下，差异无统计学意义，具有可比性（P＞0.05）。 见表1。

表1 两组患者基线特征比较

2.3 两组患者疗效比较 治疗过程中，治疗组1例患者自然受孕，对照组1例脱落，故两组各有29例患者纳入统计。

2.3.1 两组患者治疗前后卵巢功能相关血清指标比较 与治疗前比较，治疗后治疗组与对照组血清AMH水平均提高，FSH水平及FSH/LH值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较显示，何氏养巢方降低FSH水平的效果优于DHEA（P＜0.05）。 见表2。

表2 两组患者治疗前后卵巢功能相关血清指标比较

2.3.2 两组患者中医症候总积分比较 治疗前两组患者中医症候总积分差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后治疗组中医症候总积分低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。与治疗前比较，治疗后治疗组中医症候总积分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组中医症候总积分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。说明何氏养巢方显著改善了高龄DOR不孕症患者的肾虚证候。

表3 两组患者中医症候总积分比较（分）

2.3.3 两组患者IVF周期相关指标比较 在PPOS方案实施过程中，治疗组1例患者因无成熟卵泡取消周期，对照组2例患者因无成熟卵泡取消周期，故治疗组28例纳入IVF结局统计，对照组27例纳入IVF结局统计。治疗组在Gn用量、获卵数、成熟卵数、卵裂胚胎数、可利用胚胎数、优质胚胎数等方面均显著优于对照组（P＜0.05）。 见表4。

表4 两组患者IVF周期相关指标比较

此外，除成熟卵率外，两组患者的受精率、卵裂率、可利用胚胎率、优质胚胎率等参数差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图1。

图1 两组患者IVF周期中相关指标比较

2.4 两组患者安全性指标比较 两组患者治疗前后各项安全性指标均处于正常范围，治疗期间未出现不良反应。

3 讨论

DOR表现为女性卵母细胞数量和质量的下降，从而导致生育力减退。祖国医学虽然没有DOR的病名记载，但根据其临床表现，可归属于“不孕症”“血枯”等范畴。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，二七天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”肾为“肾-天癸-冲任-胞宫”轴正常运行的核心[18]，在其主导下，天癸成熟泌至，促使任脉所司精、血、津液充沛通达，冲脉所聚脏腑之血充盛，即任通冲盛，二脉相资，并使冲任二脉汇聚脏腑之血溢入胞宫，既孕则营养胎元，未孕则化为月经依时而下[19]。肾虚精血不足，天癸乏源，冲任血海空虚，源断其流，血海不能按时由满而溢，则致闭经、不孕等，故而肾虚是DOR的主要病机，因此中医临床治疗本病常以补肾填精为主[20-21]。谈勇等多位著名中医妇科及生殖专家主持的临床研究显示，在IVF前以补肾为基础的中药进行预治疗，可显著改善DOR或卵巢低反应不孕患者的获卵数量和质量，提高IVF-ET成功率[22-24]。

何氏养巢方源于“何氏妇科”，在祖传验方育麟丸的基础上化裁而成，由覆盆子、菟丝子、肉苁蓉、葛根、天冬、当归、白芍、柏子仁八味中药组成。方中菟丝子味辛而甘，善补肾精，温而不燥，《本草正义》谓其“阴中有阳，守而能走”[25]；覆盆子酸温入肾，一则收摄耗散之阴气而蓄养阴精，二则取类比象，取其累累如珠似卵子之形，又因菟丝子偏补阳气，覆盆子偏滋阴血，二者相配，寓阳中求阴，阳中求阴，以子补子之意，共为君药。当归甘温而润，补血养血，白芍补血敛阴，酸收性合，两药动静相宜，奏肝肾同补、精血相生之效，肉苁蓉、天冬补肾益精，并补阴阳，此四味共为臣药。柏子仁可透心肾、养心神、舒心气，安定患者焦虑情绪，其为佐药。葛根一味看似与种子调经无关，实则具有起阴气、升清阳之功，可促诸药益肾之气味升发，故为使药。全方君臣有序，相与宣摄，重在补肾益精血，使肾精足、阴血充，促进卵泡的发育、排出，从而达到改善卵巢储备功能的目的。

通过超排卵获得适量、高质量的卵子是IVF-ET成功的关键环节之一。女性最佳生育年龄是24～28岁，高龄DOR不孕症患者在IVF过程中容易发生卵巢反应不良，导致获卵数量减少、受精卵率和优质胚胎率亦下降，最终妊娠率下降，是IVF-ET失败的主要原因[26-27]。DHEA在临床上被广泛用于卵巢低反应（poor ovarian response，POR）患者的IVF周期，研究表明其能够显著提高接受IVF-ET治疗的POR患者的卵巢储备功能，并增加雌二醇峰值水平，改善胚胎质量和生育结局[28]。本研究显示，何氏养巢方可显著降低高龄DOR不孕女性的FSH水平及FSH/LH，提高AMH水平，获卵数、卵裂胚胎数、优质胚胎数等，并降低Gn用量，且效果优于DHEA。除成熟卵率外，治疗组及对照组在受精率、卵裂率、可利用胚胎率、优质胚胎率4个指标差异无统计学意义，可能与样本量小有关。

本研究证实，何氏养巢方可以改善肾虚型高龄DOR患者的卵巢功能、卵子质量和IVF结局，而且安全有效，值得临床推广。本研究结果为中医药应用于介入辅助生殖技术中的有效性提供了循证依据，进一步可以结合质谱技术、体外实验、多组学等研究手段，对中医药的作用机制进行深入挖掘。