闫咨儒 林娟 李娥琼

宫颈癌是女性癌症中死亡率第二位的癌症，具有较高的发病率，寻找新的治疗靶标和预后生物标志物以提高宫颈癌患者的存活率非常迫切[1]。研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在在宫颈癌的预后及各种生物学过程中都起着关键的调节作用，可作为宫颈癌诊断和预后生物标志物以及宫颈癌未来靶向治疗的靶点[2]。长链非编码叉头蛋白F1-反义RNA1(lncRNA FOXF1-AS1)也称为FENDRR，有报道lncRNA FOXF1-AS1在胃癌组织中表达下调，其表达水平与胃癌患者浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关，是影响患者预后的独立危险因素，可作为患者预后判断的参考指标[3]。FOXF1-AS1在肺癌中显著下调表达，FOXF1-AS1稳定过表达通过调节上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)抑制肺癌细胞的迁移和侵袭[4]。然而FOXF1-AS1对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响及其机制尚不清楚。microRNA参与调控宫颈癌的进展[5]，有报道miR-146b-3p下调抑制宫颈癌细胞的增殖，迁移和锚定非依赖性生长[6]。circ_0000520通过海绵化miR-146b-3p抑制宫颈癌细胞增殖，侵袭和迁移，同时促进宫颈癌细胞凋亡[7]。而FOXF1-AS1是否通过调控miR-146b-3p影响宫颈癌的进展尚不清楚。本实验旨在研究FOXF1-AS1对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响及其机制是否与miR-146b-3p有关。

1 材料与方法

1.1 宫颈癌组织和癌旁组织来源 宫颈癌组织和癌旁组织取自我院2017年5月至2019年12月确诊的35例宫颈癌患者，经手术切除癌组织，患者手术前未进行过手术及放化疗，患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂 宫颈癌细胞SiHa购自上海沪峥生物科技有限公司；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自杭州新景生物试剂开发有限公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；MTT试剂盒、凋亡检测试剂盒购自日本同仁研究所；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物科技公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 细胞处理与分组 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养宫颈癌细胞SiHa，取对数生长期SiHa，将pcDNA、pcDNA-FOXF1-AS1转染至SiHa中，记为pcDNA组、pcDNA-FOXF1-AS1组；将pcDNA-FOXF1-AS1分别与miR-NC、miR-146b-3p转染至SiHa中，记为pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC组、pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FOXF1-AS1和miR-146b-3p表达水平 提取组织和细胞总RNA，反转录成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，反应体系：2 μl反转录产物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl无菌水；反应条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；熔解曲线：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。相对表达量用2-△△Ct法计算。FOXF1-AS1和miR-146b-3p分别以GAPDH和U6为内参，FOXF1-AS1上游引物序列：5’-TTCATCGGCTGCGTATTCG-3’，下游引物序列：5’-TTGCCTTCTAGTCGCCTCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游引物序列：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；miR-146b-3p上游引物序列：5’-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3’，下游引物序列：5’-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。

1.5 MTT检测细胞增殖 细胞培养至48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，振荡反应10 min，用酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成数 取对数生长期细胞，制成1×104个/ml细胞悬液，以每孔100个细胞接种于6孔板中，培养2周出现肉眼可见克隆时终止培养，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，PBS漂洗后用结合缓冲液重悬，加后入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混匀，避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达 用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE、转膜、封闭后，加入稀释好的一抗4℃孵育过夜，加入稀释的HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.9 双荧光素酶报告实验检测FOXF1-AS1和miR-146b-3p的靶向关系 构建FOXF1-AS1的野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-FOXF1-AS1和MUT-FOXF1-AS1，其分别与miR-NC和miR-146b-3p共转染至SiHa细胞中；按照说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 FOXF1-AS1在宫颈癌中的表达 与癌旁组织相比，宫颈癌组织中FOXF1-AS1表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2 过表达FOXF1-AS1对SiHa增殖的影响 与pcDNA组相比，pcDNA-FOXF1-AS1组FOXF1-AS1表达水平升高，miR-146b-3p表达水平降低，细胞OD值降低，细胞克隆形成数减少(P<0.05)。见表2。

表2 过表达FOXF1-AS1对SiHa增殖的影响

2.3 过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡的影响 与pcDNA组相比，pcDNA-FOXF1-AS1组细胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表达水平升高，pro-caspase3表达水平降低(P<0.05)。见图1，表3。

图1 过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡及caspase3蛋白表达的影响(A 过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡的影响；B 过表达FOXF1-AS1对caspase3蛋白表达的影响)

表3 过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡的影响

2.4 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p Starbase预测显示FOXF1-AS1与miR-146b-3p具有结合位点；与miR-NC组相比，miR-146b-3p转染WT-FOXF1-AS1的细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)。见图2，表4。

表4 双荧光素酶报告实验

图2 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p

2.5 miR-146b-3p能逆转过表达FOXF1-AS1对SiHa增殖凋亡的影响 与pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC组相比，pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p组细胞OD值升高，克隆形成数增多，细胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3表达水平降低，pro-caspase3表达水平升高(P<0.05)。见图3，表5。

图3 miR-146b-3p能逆转过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡及caspase3蛋白表达的影响(A miR-146b-3p能逆转过表达FOXF1-AS1对SiHa凋亡的影响;B miR-146b-3p能逆转过表达FOXF1-AS1对caspase3蛋白表达的影响)

表5 miR-146b-3p能逆转过表达FOXF1-AS1对SiHa增殖凋亡的影响

3 讨论

目前宫颈癌治疗方式主要还是以手术为主，放化疗为辅；肿瘤精准治疗的提出表明了靶向性，精准化个性靶向治疗是今后宫颈癌临床治疗的大方向[8,9]。研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中占重要作用，FOXF1-AS1在肺腺癌中表达降低，其表达与单独的总体生存相关，是一种新的潜在诊断、预后生物标志物[10]。FOXF1-AS1在非小细胞肺癌中作为肿瘤抑制因子起作用[11]。而有研究报道FOXF1-AS1在骨肉瘤组织和细胞系中上调表达，沉默FOXF1-AS1通过降低MMP-2和MMP-9的表达在体内外显著抑制细胞增殖，迁移，侵袭和肿瘤生长[12]。以上研究表明FOXF1-AS1在不同肿瘤中可能起不同作用。本实验结果显示，宫颈癌组织中FOXF1-AS1表达水平显著低于癌旁组织；过表达FOXF1-AS1后，SiHa细胞中miR-146b-3p表达水平降低，细胞OD值降低，细胞克隆形成数减少，细胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表达水平升高，pro-caspase3表达水平降低；表明过表达FOXF1-AS1可能抑制宫颈癌SiHa细胞增殖，促进细胞凋亡。

有研究表明下调miR-146b-3p可抑制宫颈癌细胞的增殖，迁移[6]。且研究报道miR-146b-3p在非小细胞肺癌患者外周循环血中呈显著过表达，可用作早期非小细胞肺癌的诊断标志物[13]。circ_0071662通过使miR-146b-3p变海绵抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭[14]。miR-146b-3p在甲状腺癌组织和细胞系中高表达，增强乳头状甲状腺癌细胞的侵袭和转移[15]。本实验结果显示，FOXF1-AS1可靶向调控miR-146b-3p，且miR-146b-3p可逆转过表达FOXF1-AS1对SiHa增殖、凋亡的影响。提示，FOXF1-AS1可能通过调控miR-146b-3p表达抑制SiHa增殖，促进SiHa凋亡。

综上所述，过表达FOXF1-AS1可能通过下调miR-146b-3p抑制宫颈癌SiHa细胞增殖，促进细胞凋亡。