杨三虎 何伟

食管癌(esophageal cancer，EC)为临床常见消化道肿瘤，多发于40岁以上人群，典型的症状为进行性咽下困难，严重影响患者生命健康及生活质量[1,2]。手术为治疗EC最重要的方法，尤其是以胸腔镜为代表的微创手术，较传统手术具有更高有效性及安全性，临床应用广泛[3]。国内外均有报道指出，EC恶性生物学行为如肿瘤分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度等，是肿瘤术后复发的危险因素[4,5]。研究指出，EC患者ALC1基因表达升高，可增强癌细胞增殖、侵袭及转移能力，导致EC总生存率下降[6]。微小RNA-1299(miR-1299)被证实在EC组织中的表达水平降低，可能与癌细胞的迁移和侵袭能力相关[7]。此外，V型胶原蛋白α2链(COL5-A2)被认为是食管鳞癌发生、发展的关键基因，与患者预后密切相关[8]。基于此，本研究尝试探究ALC1、miRNA-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为的关系及预测胸腹腔镜外科手术后复发的效能，旨在为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月至2019年6月西安军医大学唐都医院胸腹腔镜外科手术治疗后1年内复发的EC患者45例，作为研究组，其中男25例，女20例；年龄49～78岁，平均年龄(64.25±6.86)岁。另选取胸腹腔镜外科手术治疗后1年内未复发的EC患者45例，作为对照组，其中男28例，女17例；年龄47～79岁，平均年龄(63.58±7.7)岁。2组一般资料具有均衡性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①EC的诊断及复发诊断均参照相关标准[9]，并经病理诊断确诊；②符合EC手术指征[10]；③无神经系统疾病、心理障碍；④临床资料完整；⑤患者知晓本研究，已签署同意书。

1.2.2 排除标准：①血液系统疾病患者；②合并其他恶性肿瘤者；③严重心脑血管疾病患者；④免疫性疾病、感染性疾病患者；⑤肝肾等脏器功能严重障碍者。

1.3 方法

1.3.1 EC组织指标检测方法：2组术后均留取EC组织，并于入组当天取活检组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组织中ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达水平，具体操作如下：称取待检组织100 mg，置于EP试管中，加入1 ml裂解液后充分研磨，随后于低温下提取总RNA，核酸测定仪测定RNA含量，将RNA反转录为cDNA，并进行扩增，条件为95℃ 5 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环，ALC1引物上游序列为：5’-GGTGGAGTTGGCATGA

ACTT-3’，下游序列为：5’-CACTCAACTGGAGGTCAG

CA-3’；miR-1299引物上游序列为：5’-TAAAGGTATG

GAGCGATGTGA-3’，下游序列为：5’-GGGTAGCGAA

AGGTGTAGAAG-3’；COL5 A2引物上游序列为：5’-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3’，下游序列为：5’-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3’；上下游引物均购自广州锐博生物科技有限公司，采用2-ΔΔCt法计算ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达水平。

1.3.2 血清恶性生物学行为指标检测方法：包括血清半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、半乳糖凝集素-3(galectin-3)，采集患者术前空腹静脉血3 ml，以3 500 r/min转速、8 cm半径离心处理5 min，取血清置于-70℃冷藏室保存，采用酶联免疫吸附试验检测上述指标水平，试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，检测操作由专业人员严格按照试剂盒说明书完成。

1.4 观察指标 (1)2组一般资料及血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平，一般资料包括年龄、性别、体质量指数(Body mass index，BMI)、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症。(2)2组术后、入组时EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达情况。(3)探究术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA与血清恶性生物学指标的相关性。(4)术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征，包括年龄、性别、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症、肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度，肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度均于术前参照相关指南[11]进行评估。(5)探究术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2表达水平与恶性生物学行为的关系，及预测EC术后复发的效能。

2 结果

2.1 2组一般资料、血清恶性生物学行为指标比较 2组患者年龄、性别比、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症比较差异无统计学意义(P>0.05)；研究组患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组一般资料、血清恶性生物学行为指标比较 n=45,例(%)

2.2 2组EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA比较 研究组术后、入组时EC组织ALC1、COL5-A2 mRNA均较对照组高，miR-1299 mRNA较对照组低(P<0.05)。免疫组织化学法检测显示，研究组术后、入组时EC组织ALC1、COL5-A2呈强阳性表达，miR-1299呈弱阳性表达；对照组术后、入组时EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2呈弱阳性表达，miR-1299呈强阳性表达。见表2。

表2 2组EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA相对表达量比较

2.3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征比较 以术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2平均值作为分界点，分为高表达、低表达患者。高表达与低表达患者的年龄、性别、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症差异无统计学意义(P>0.05)；高表达与低表达患者的肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征比较 例(%)

2.4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表达与血清恶性生物

学行为指标的相关性 Spearman相关系数模型分析相关性，发现术后EC组织ALC1、COL5-A2表达与血清Gal-9、VEGF、Galectin-3间正相关，miR-1299与血清Gal-9、VEGF、Galectin-3间呈负相关(P<0.05)。见图1～3。

图1 ALC1与血清恶性生物学行为指标的相关性

2.5 ALC1、miR-1299、COL5-A2与恶性生物学行为的关系 Spearman相关系数模型分析相关性，发现术后EC组织ALC1、COL5-A2表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度间存在正相关关系，miR-1299表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度间存在负相关关系(P<0.05)。见表4。

图2 COL5-A2与血清恶性生物学行为指标的相关性

图3 miR-1299与血清恶性生物学行为指标的相关性

表4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表达水平与恶性生物学行为的相关性分析

2.6 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的效能 绘制术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2联合预测EC术后复发的ROC曲线，显示各指标联合预测的AUC最大，为0.872，最佳预测敏感度、特异度分别为86.67%、80.00%(P<0.05)。见表5，图4。

表5 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的效能

图4 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的ROC

3 讨论

调查显示，2018年全球36种癌症中，EC的发病率和死亡率分别居第7位和第6位[12]。尽管近年来EC的诊断技术和多学科治疗取得明显进展，但EC患者的5年生存率仍然低于20%[13,14]。肿瘤的复发转移，是导致预后不佳的主要因素，积极探索相关特异性生物标志物，对控制肿瘤进展、延长患者生存期具有重要意义[15,16]。

近年来，基因诊断与基因治疗在恶性肿瘤中的作用越来越受临床重视。ALC1为肝癌的最新候选癌基因，是从人体肝癌细胞的染色体1q21区分离并克隆的一个新基因，具有调控基因转录的功能，也是SNF-2类家族中具有致癌作用的基因[17,18]。但其在EC发生发展及复发中的作用鲜有研究报道。本研究发现，EC组织中ALC1基因表达水平明显升高，胸腹腔镜外科手术后其表达水平呈降低趋势，但EC术后复发患者的EC组织中ALC1基因表达水平高于未复发患者，提示ALC1基因表达可能与EC的发生发展及术后复发有关，可能与其调控下游基因及促进细胞增殖相关。ALC1基因具有上调Cdk2及细胞周期蛋白CyclinE、下调蛋白p53及其下游效应基因p21表达的作用，能加速细胞G1期到S期的进程，且能促进DNA合成，从而促进肿瘤细胞增殖，导致肿瘤进展、复发[19]。

miR是一类高度保守的非编码RNA，越来越多的证据指出miR在癌症的基因表达调控和信号转导通路中发挥关键作用[20,21]。有报道指出miR-1299可通过负向调控信号转导及转录激活因子3信号通路，抑制癌细胞的迁移、侵袭[22]。本研究还发现，EC组织中miR-1299表达水平明显降低，手术治疗后其表达水平有升高，但术后复发患者的EC组织中miR-1299表达水平仍明显偏低，可能与EC发生发展、术后复发有关。本研究还发现，COL5-A2基因在EC组织中的表达明显升高，且术后复发患者高于未复发患者。COL5-A2是胶原家族的重要成员，被认为与癌症发生有关，已有研究证实其在舌鳞状细胞癌、膀胱癌组织中的表达均升高，可促进癌细胞增殖、转移[23]。但其在EC中的具体作用机制尚未明确，仍有待进一步探究。

本研究分析其与EC患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平的相关性，结果发现血清Gal-9、VEGF、Galectin-3与术后EC组织ALC1、COL5-A2表达呈正相关，与miR-1299表达呈负相关。Gal-9可诱导巨噬细胞、T细胞、胸腺细胞等多种类型细胞的凋亡，与肿瘤的凋亡、转移等机制密切相关[24,25]。VEGF为肿瘤血管生成的主要推动因子，可促进肿瘤内新血管形成，为肿瘤的增殖、转移提供动力[26]。Galectin-3具有调节细胞生长、黏附、分化及凋亡的作用，可促进食管癌新血管生成及肿瘤的浸润、转移[27]。由此可见，ALC1、miR-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为有关。本研究还发现，肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度与术后EC组织ALC1、COL5-A2呈正相关，与miR-1299呈负相关，进一步证实了ALC1、miR-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为均存在密切相关性。基于上述研究，我们首次采用ROC曲线探究ALC1、miR-1299、COL5-A2预测EC术后复发的效能，结果发现各指标预测EC术后复发的AUC均>0.7，具有良好预测价值，尤其是各指标联合预测的AUC高达0.872，可为临床预测患者术后复发风险提供更准确信息。

综上所述，EC组织中ALC1、miR-1299、COL5-A2基因表达异常，与EC恶性生物学行为密切相关，且各指标联合在预测患者术后复发方面具有良好效能，具有较高临床应用价值。