陈林勇 李国富 刘建民 任恒星 何 环苗 彪 赵 娜 宋燕莉

(1.河南理工大学资源环境学院，454000 河南焦作；2.煤与煤层气共采国家重点实验室，048000 山西晋城；3.中国矿业大学化工学院，煤炭加工与清洁利用教育部 重点实验室，221116 江苏徐州)

0 引 言

根据成因类型，煤层气可分为生物成因气和热成因气[1-2]。其中，生物成因气又可分为成煤物质在早期形成的原生生物气和成煤后煤层被抬升到浅部在微生物的作用下形成的次生生物气[3-4]。通常认为原生生物气是由早期泥炭沼泽环境中的泥炭或低级煤通过细菌分解等一系列复杂过程生成[5]，其生成机理可用ZINDER et al于1993年提出的四阶段发酵理论进行概括性的描述[6]。次生生物气的生成机理研究经历了由浅到深的过程，早期认为是由煤化过程中产生的湿气和正烷烃等经细菌作用而形成[3]，目前可较为详细地阐明其代谢途径[7-9]。

影响煤生物产气效率的诸多因素可以归纳为两类，一类影响底物的可利用性，如煤阶、煤样粒度、煤的显微组分和孔裂隙等[10-14]；另一类影响菌群的活性，如温度、pH、Eh和营养成分等[13，15]。因此，为提高产气效率，通常可从上述两方面优化实验条件来提高煤的生物可利用性[16-19]或增强菌群的活性[20]。此外，还可以通过解除产气的抑制因素来提高产气效率。在厌氧消化领域，胺抑制、酸抑制和重金属抑制等已经得到了广泛的关注和研究[21-26]，然而针对煤制生物气抑制因素的研究还较少。有学者研究证实了煤的添加量对产甲烷抑制现象的存在，例如，YOON et al[27]研究发现发酵液中超过6 g/L的褐煤剂量对生物生成甲烷有抑制作用；王保玉等[11]研究发现煤粉的存在抑制了微生物对营养液的利用。部分学者研究了可能对产甲烷有抑制作用的因素，例如，张倩等[14]认为石英砂、菱铁矿、水化硅酸钙和氧化亚铁镁等矿物对煤的生物产气存在抑制作用；董利超等[28]认为腐植酸前体物质木质素抑制褐煤生物甲烷化，这些研究多侧重于通过外源物质的添加证实抑制作用的存在。为提高煤制生物甲烷的产气效率，有必要研究对产甲烷有抑制作用的因素，为后续研究解除产气抑制因素提供参考。因此，笔者通过分析发酵液成分在产气过程中的变化及煤的甲醇萃取物的产气特征研究了过量煤粉对产甲烷的抑制现象及成因。

1 实验部分

1.1 煤样与菌源

实验所用煤样采自河南义马，将新鲜煤样粉碎至0.15 mm～0.20 mm后于70 ℃干燥备用，煤样的工业分析结果见表1。实验所用菌源为蓝焰煤层气公司SH121井排采水。将10 kg河南义马块煤加入200 L自制的发酵罐中，再将采集到的40 L新鲜排采水样品加入发酵罐中，然后加入40 L 0.1%YE培养基(酵母粉YE 1 g，K2HPO42.9 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 1.8 g，MgCl20.4 g，超纯水1 L)，通入高纯氮气(99.99%)曝气30 min以驱除培养液中的氧气，于30 ℃恒温培养，通过罐体上的压力表观察产气量，利用气相色谱仪(Angilent 7890，美国)检测甲烷体积分数的变化。待甲烷产量趋于平缓后，放出40 L发酵液，然后补加40 L新鲜的灭菌的0.1%YE培养基，重复以上操作5次，保证富集驯化得到能够利用煤产气的稳定菌源。

表1 煤样的工业分析Table 1 Proximate analysis of coal samples

1.2 实验方法

1.2.1 煤生物模拟产气实验

在500 mL厌氧瓶中加入300 mL无机盐培养基(K2HPO42.9 g，KH2PO41.5 g，NH4Cl 1.8 g，MgCl20.4 g，超纯水1 L)和30 g煤样，以不加煤样为对照组，通入高纯氮气驱氧，铝封后湿热灭菌，每组做3个平行实验。灭菌冷却至室温后，利用无菌注射器接种10 mL前期富集培养的稳定菌液，接种液清澈、无沉淀或悬浮物(见图1a)。于30 ℃恒温培养，实验周期为120 d，定期通过压力表记录压力变化，利用气相色谱仪分析气体成分，根据压力及气体成分计算产甲烷的量。

转接实验：选取上述实验组中产甲烷量最高的平行样作为菌源，在100 mL厌氧瓶中加入40 mL无机盐培养基和4 g煤样，接种1 mL菌液。为保证菌源的均匀性，接种前将菌液摇匀，使沉淀的煤粉与发酵液充分混合，发酵液呈黑色(见图1b)。其他操作同1.2.1节。

图1 实验所用接种液Fig.1 Inoculum used in experimentsa—Inoculum without pulverized coal；b—Inoculum with pulverized coal

煤粉量梯度实验：以前期富集培养的稳定菌液为菌源，在100 mL厌氧瓶中分别加入0.01 g，0.05 g，0.25 g，1.25 g和6.25 g煤样，接种10 mL菌液，加入40 mL 0.1%YE培养基。其他操作同1.2.1节。定期取发酵液，利用Agilent HPLC-QTOF(1290-6530)液相色谱质谱联用仪测定液体成分。色谱柱为ZORBAX SB-C8，柱温为25 ℃。流动相A为100%甲醇，流动相B为含0.1%甲酸的超纯水，流动相梯度见表2。离子源设置为干燥气温度300 ℃，流速11 L/min，雾化器压力5 344.738 kPa，毛细管电压3 500 V，碎裂电压130 V，狭缝电压55 V。

表2 液相色谱流动相梯度Table 2 Mobile phase gradient of liquid chromatography

1.2.2 义马煤甲醇萃取物的生物产气实验

在索氏提取器中加入200 mL甲醇和50 g煤粉，于60 ℃萃取100 h。萃取完成后，在45 ℃下使用旋转蒸发仪将萃取液浓缩，用甲醇定容至100 mL，利用液相色谱质谱联用仪测定液体成分。

分别在两个250 mL厌氧瓶中加入2 mL甲醇萃取物(实验组)和2 mL甲醇(对照组)，并设置3个平行，通氮气保护。每个厌氧瓶中加入120 mL 0.1%YE培养基，铝封后湿热灭菌。利用注射器为每个瓶中接种5 mL富集培养的稳定菌液，培养方式同1.2.1节。

2 结果与讨论

2.1 煤生物产气特征

模拟实验、转接实验和煤粉量梯度实验的累计产甲烷量见图2。由图2a可以看出，模拟实验中实验组和对照组累计产甲烷量分别为0.42 mmol和0.16 mmol，由于没有额外添加有机营养物质，证明了微生物可以利用煤产甲烷。对照组(没有添加煤)仍有甲烷产生，说明接种会带入一定量的物质作为产气底物，由于接种液清澈、无沉淀或悬浮物，又说明由接种带入的底物是溶解性物质，结合1.1节所述可知，菌源富集驯化的过程就是煤生物发酵的过程，接种液即发酵液中含有微生物降解煤产气的中间产物[29-30]。由表1可知，实验前后煤的灰分和挥发分含量降低，其中灰分质量分数由29.20%降低至19.70%，挥发分质量分数由43.87%降低至38.09%，说明灰分和挥发分参与了煤生物气的转化，这与张倩等[14]的研究结论一致。

图2 模拟实验和转接实验及煤粉量梯度实验的累计产甲烷量Fig.2 Cumulative methane production of simulation experiment and transfer experiment and gradient experiment of coal consumptiona—Simulation experiment；b—Transfer experiment；c—Gradient experiment of coal consumption

由图2b可知，转接实验中实验组和对照组累计产甲烷量分别为0.15 mmol和0.19 mmol，实验组产气量低于对照组产气量，与正常情况时相反。这是由于转接实验接种时带入了少量煤粉，结合最终的累计产甲烷量推测，接种液带入的煤粉作为底物参与了甲烷的产生，实验组中加入的煤不但没有作为产气底物参与甲烷的产生反而由于煤粉过量产生了抑制作用，使得实验组产气量低于对照组产气量，这种抑制作用同样出现在其他学者的研究[11，27]中。

由图2c可以看出，煤粉量梯度实验第一产气阶段持续了40 d，比文献[29，31，32]报道的时间长，这是由于0.1%YE培养基所含的有机营养成分少，对微生物的刺激作用减弱。快速产气阶段主要在第40天～第80天。煤粉量梯度实验H2体积分数见图3。由图3可知，在整个实验周期内，H2体积分数一直维持在很低的水平，在第40天～第80天有微弱增加，表明此阶段H2的生成量大于消耗量，H2

图3 煤粉量梯度实验H2体积分数Fig.3 Volume fraction of hydrogen of gradient experiment of coal consumption

相对富余，对应快速产气阶段，说明H2在产甲烷过程中起重要作用，产甲烷过程需要较高的氢分压[16]。图4所示为0.25 g煤实验组CH4和CO2的体积分数。由图4可知，在第40天～第80天CO2含量降低，说明CO2被利用。80 d之后H2含量下降，CO2含量上升，对应产气的稳定期，说明此阶段H2的生成量不足，利用CO2产甲烷的过程趋于结束。事实上，从煤的元素组成来看，其氢碳物质的量比远低于形成甲烷气体所需的4∶1，氢元素是生物甲烷生产过程中的重要限制因素，因此，有学者[17，27]通过向煤中添加富氢的生物质来提高生物甲烷产量。由图4还可知，CH4和CO2含量未呈现出同步变化的规律。现有的理论认为，产甲烷的甲基营养型途径只在盐湖等特定的生态环境中才考虑其影响[16]，乙酸发酵途径使CH4和CO2含量的变化出现同步规律，结合H2对产甲烷的影响及CH4和CO2含量变化规律可知，本次产气呈现CO2还原途径特征。

图4 0.25 g煤实验组CH4和CO2的体积分数Fig.4 Volume fractions of CH4 and CO2in group 0.25 g coal

由图2c还可知，6.25 g煤的实验组在整个实验周期内均未出现快速产气阶段，在经历了第一产气阶段后，累计产气量迅速被其他实验组及对照组超越，煤粉量显示出明显的产甲烷抑制作用。0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤的实验组累计产甲烷量均高于对照组及6.25 g煤的实验组累计产甲烷量，在第120天时约为0.16 mmol。这些实验组的产气量趋于一致，并没有随着煤粉量的增加而增加，可能与嗜甲烷菌等其他微生物的作用有关，但其机理还有待深入研究。实验组产气量减去对照组产气量后除以煤粉量为产甲烷效率，0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤和6.25 g煤的实验组产甲烷效率分别为3.12 mmol/g，0.60 mmol/g，0.14 mmol/g，0.02 mmol/g和-0.01 mmol/g，增加底物煤粉量并未提高产气效率，有研究认为这是由于煤粉颗粒产生堆积，有效参与传质的比表面积并未增加[18]。事实上，当煤粉超过一定量后，不仅有效传质比表面积未增加，反而产生了抑制作用[27]，导致产甲烷效率出现负值。

厌氧消化抑制因素研究表明，氨抑制的产生是由于底物蛋白含量高[19，22]，酸抑制的产生是由于挥发性脂肪酸(VFA)累积[24，26]，对煤制生物甲烷而言，作为底物的煤其结构本身不具备蛋白含量高的特点，且发酵过程中的VFA作为产甲烷的前体物质其含量很低[6，29]，因此，氨抑制与酸抑制均不会出现在煤制生物甲烷过程中。重金属既可以导致酶结构和功能的破坏，又是酶的组成成分[21]，其对产甲烷菌毒性由大到小的顺序为Cu，Zn，Cr，Cd，Ni，Pb[21，33]。煤中的重金属含量低[34]，为激活产甲烷菌群的活性往往需要向培养基中额外添加重金属作为微量元素液[35]，而本实验所用培养基中并未添加重金属，因此排除了重金属的毒性抑制作用。

图5所示为煤粉量梯度实验不同时间发酵液的LC-MS谱。实验启动时(见图5a)，实验组的色谱与对照组的色谱相似，质荷比(m/e)为130.1的物质含量很低，在液相色谱质谱上未出峰。第40天时(见图5b)，0 g煤、0.01 g煤、0.05 g煤、0.25 g煤、1.25 g煤、6.25 g煤的实验组发酵液中m/e为130.1的物质含量之比约为2∶2∶1∶1∶1∶1，说明该物质是发酵过程产生的中间产物。第80天时(见图5c)，以上各实验组发酵液中m/e为130.1的物质含量之比约为1∶1∶2∶1∶1∶1，与第40天时相比发生了变化，说明该物质在发酵过程中呈现动态变化规律。第120天时(见图5d)，以上各实验组发酵液中m/e为130.1的物质含量之比约为1∶4∶6∶5∶1∶9，除了含煤1.25 g实验组之外，大体呈现出底物中煤粉量越多，发酵液中m/e为130.1的物质含量越高的趋势，但并未呈现明显的比例关系。结合累计产甲烷量可知，6.25 g煤实验组m/e为130.1的物质含量最高，相应的产甲烷量最少，0.01 g煤、 0.05 g煤、 0.25 g煤的实验组m/e为130.1的物质含量相当，最终累计产甲烷量基本相等，说明m/e为130.1的物质对产甲烷过程有抑制作用。

图5 煤粉量梯度实验不同时间发酵液的LC-MS谱Fig.5 LC-MS chromatograms of fermentation liquor during different periods of gradient experiment of coal consumptiona—Day 0；b—Day 40；c—Day 80；d—Day 120

2.2 煤中甲醇萃取物产甲烷实验

图6所示为煤的甲醇萃取物色谱和累计产气量。由图6可知，m/e为130.1的物质为煤的甲醇萃取物主要成分之一。对照组产甲烷量为1.73 mmol，实验组产甲烷量仅为0.03 mmol，与对照组相比，实验组底物中包含煤的甲醇萃取成分即m/e为130.1的物质，这种成分对产甲烷产生了明显的抑制作用，与前文所述m/e为130.1的物质对产甲烷过程有抑制作用结论一致，经过MassHunter Workstation软件分析，其分子式可能为C6H11NO2，具体的结构式还有待深入研究。

图6 煤的甲醇萃取物色谱和累计产气量Fig.6 LC chromatogram and cumulative methane production of methanol extract of coal

值得注意的是，本研究出现的抑制现象并没有出现在所有的研究中，有的研究显示产甲烷量与煤粉量呈现正相关[36]，这可能与实验所用的菌源相关；有的研究认为经培养产气后，群落多样性降低[27]，群落结构发生了较大变化[37]。本研究产甲烷抑制现象的产生，可能与某些能降解抑制物的微生物的缺失有很大关系，但还需要进一步的研究证实。

3 结 论

1) 本研究产甲烷实验中CH4和CO2的含量未显示出协同变化的规律，产气呈现CO2还原途径特征，产甲烷过程需要较高的氢分压。煤粉过量(100 mL发酵液中加入12.5 g煤粉)时显示出明显的产甲烷抑制作用，说明微生物在利用煤产气的代谢过程中会产生对产气有抑制作用的物质，单纯增加底物煤粉量并未提高产甲烷效率。

2) 过量的煤粉使发酵液中的质荷比为130.1的物质含量增加，对产甲烷过程产生了抑制作用，导致产气量下降，抑制物的分子式可能为C6H11NO2，具体的结构式还有待深入研究。