余婷婷，袁莲莲，李莹，焦裕冰，申莉莉，王凤龙，黄坤，王勇，李斌，章松柏，杨金广

摘  要：為挖掘具有纳米硒化能力的生防菌株，开发烟草病毒病的绿色防治材料，从烟草病毒病重病田块健株根际土壤中筛选获得到一株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens KBD-1，对其进行了纳米硒化，采用Real-time PCR和Western blot测定了两者对烟草常见病毒基因表达的影响，并采用接种法测定了其对烟株相应病毒病的防治作用。结果表明，纳米硒化后的KBD-1菌体外部存在高密度电子颗粒，在X射线11.22 keV处出现硒的特征吸收峰。纳米硒化后的P. fluorescens KBD-1菌液浓度在5×105 cfu/mL（单质硒浓度0.25 mg/L）时，对烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）4种病毒病的防治效果均在88.0%以上，对CMV防治效果最高达91.4%，该浓度处理对烟株促生效果显著。荧光假单胞菌KBD-1可成功将亚硒酸钠还原生成纳米硒，并能增强原始菌株的抗烟草病毒活性和促生效果。

关键词：纳米硒;荧光假单胞菌;烟草病毒病;病毒抑制;促生作用

Inhibition of Tobacco Virus Diseases by Nano-selenated Pseudomonas fluorescens KBD-1

YU Tingting1，2， YUAN Lianlian2， LI Ying2， JIAO Yubing2， SHEN Lili2， WANG Fenglong2， HUANG Kun3，

WANG Yong4， LI Bin5， ZHANG Songbai1*， YANG Jinguang2*

（1. College of Agronomy， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China; 2. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 3. Honghe Company of Yunnan Tobacco Company， Kunming 650000， China; 4. Liangshan Company of Sichuan Provincial Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China; 5. Sichuan Tobacco Company， Chengdu 610000， China）

Abstract： In order to explore biocontrol strains with nano-selenized ability and develop green antiviral materials to prevent tobacco virus diseases， Pseudomonas fluorescens KBD-1 was identified from the rhizosphere soil of healthy plants in the field with serious tobacco virus diseases. The nano-selenized activity of P. fluorescens KBD-1 was investigated in this study， and its inhibitions against four main tobacco viruses were determined by using the methods including Real-time PCR and Western blot under the treatments of original strain and nano-selenized strain. The results showed that there were high density electron particles outside the nano-selenized KBD-1 and the characteristic absorption peak of selenium appeared at 11.22 keV X-ray. When the concentration of P. fluorescens KBD-1 bacterial fluid after nano-selenization was 5×105 cfu/mL （0.25 mg/L selenium）， the control effects against Tobacco mosaic virus （TMV）， Potato virus Y （PVY）， Cucumber mosaic virus （CMV） and Tomato spotted wilt virus （TSWV） were all above 88.0%， and the highest control effect against CMV was 91.4%. The treatment at this concentration also had significant growth-promoting effect on tobacco plants. This study showed that P. fluorescens KBD-1 successfully reduced sodium selenite to produce nano-selenium， and enhanced the antiviral activity and growth-promoting effect of the original strain.

Keywords： nanometer selenium; Pseudomonas fluorescens; tobacco virus diseases; virus inhibition; role in the growth

病毒病是烟草普遍发生的一类侵染性病害[1]，其中造成严重经济损失的种类主要包括烟草花叶病毒病（TMV）、马铃薯Y病毒病（PVY）、黄瓜花叶病毒病（CMV）、番茄斑萎病毒病（TSWV）等[2]。研究表明TMV、CMV、PVY复合侵染现象普遍，产量和品质受损严重[3-4]，防治主要以早期预防为主，但收效甚微，迄今还没有效果很好的单一防治措施，病害发生后有效治疗药剂更是缺乏[5]。

基金项目：中国烟草总公司贵州省公司遵义市公司项目（201921）;中国烟草总公司四川省公司科技项目（SCYC202008）;中国烟草总公司项目硒是植物必需的微量元素之一[6]，然而，如果硒含量过高，会导致严重健康问题。硒有4种价态，使用不当极易造成硒中毒[7]，而纳米硒（纳米尺寸的红色单质硒）具有较高吸收率和较低毒性，这使得硒纳米化研究具有更重要意义[8]。生物法制备纳米硒高效且安全[9-10]，通常利用微生物进行生物合成，如固氮红细菌（Rhodobacter azotoformans）[11]、假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila MBR）[12]等。目前，微生物合成纳米硒在医学上用于抗氧化剂[13]、抗菌剂[14]、生物强化剂[15]，工业上用于环境净化剂[16]，农业上可有效减少土壤中镉污染和水稻镉积累[17]，而关于微生物合成纳米硒后抗烟草病毒病的研究较少。荧光假单胞菌[18]已被证明可作为生防菌防治植物真菌、细菌等病害，而荧光假单胞菌及其纳米硒化后对烟草常见病毒病的拮抗作用及对烟株本身是否有影响尚未得到验证。

本研究筛选了一株对TMV具有显著拮抗活性的荧光假单胞菌KBD-1（Pseudomonas fluorescens KBD-1），并制备形成P. fluorescens KBD-1纳米硒菌液，探究其纳米硒化菌液对烟草常见病毒TMV、CMV、PVY、TSWV的抑制活性，进一步探讨其对烟草的促生效应，以期为烟草主要病毒病的绿色防治提供材料准备和科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验材料  枯斑三生烟（Nicotiana tabaccum cv. Samsun NN），K326（N. tabaccum cv. K326），TMV、CMV、TSWV、PVY毒源均由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心保存。

荧光假单胞菌KBD-1及其纳米硒菌液：从云南腾冲烟草病毒病高发区采集健株根际土壤，称取2 g，加入20 mL ddH2O，28 ℃、180 r/min培养16 h，静置后取上清于LB固体培养基划线，28 ℃培养。鉴定并纯化1株荧光假单胞菌菌株，命名为P. fluorescens KBD-1。挑取生长良好单一菌落接种于LB液体培养基（2瓶，每瓶50 mL），28 ℃、150 r/min振荡培养20 h，随后其中一瓶以1%接种量加入到150 mL亚硒酸钠还原菌培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养，2～5 d后观察菌液颜色，待菌液出现红色，扫描电镜（Scanning Electron Microscope， SEM）进行检测，进一步确定P. fluorescens KBD-1可将亚硒酸钠还原生成红色单质硒，命名为P. fluorescens KBD-1-Se。

1.1.2  主要试剂  LB培养基（购自北京国药集团化学试剂有限公司），亚硒酸钠还原菌培养基：1 L LB液体培养基含1 mmol亚硒酸钠，TMV、CMV、PVY、TSWV抗体（兔源，Agadia），Actin抗体（鼠源，CWBIO）。

1.2  KBD-1及其纳米硒菌液对烟草病毒病抗性测定

1.2.1  KBD-1及其纳米硒菌液对烟草常见病毒基因表达的影响  各取10 mL KBD-1（浓度为108 cfu/mL）和KBD-1-Se菌液（单质硒含量为0.25 mg/L、菌浓度108 cfu/mL），分别与等体积40倍TMV（或CMV、PVY、TSWV）汁液（毒源叶片研磨，1∶40稀释，过滤）混合15 min，摩擦接种大小一致的4叶期K326烟株同位叶片1片，每个处理重复3株，25 ℃，16 h光照培养，5 d后取接种叶，液氮冷冻。Real-time PCR检测：Trizol法提取叶片总RNA，合成cDNA。Actin为内参，浸润PBS样品的CT值为标准1，用相对CT法公式2-??CT，利用表1引物于7500 Fast上进行Real-time PCR反应，计算不同处理叶片CP基因RNA相对表达量。Western blot检测：提取接种叶总蛋白，保持上样蛋白浓度一致，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜。取出PVDF膜封闭1 h，按1∶2000分别稀释TMV-CP、CMV-CP、PVY-CP、TSWV-CP一抗（兔源）4 ℃孵育过夜，按1∶5000稀释HRP标记的二抗，摇床上孵育2 h。TBST洗膜后涂抹发光液ECL（SuperSignal West Pico Trial Kit），于化學发光成像分析仪中测定相应病毒CP蛋白相对表达量。

1.2.2  KBD-1及其纳米硒菌液对枯斑三生烟叶TMV的室内防治效果  半叶法检测试验：按照1.2.1方法制成KBD-1及其纳米硒菌液与TMV汁液混合液，摩擦接种长势一致的枯斑三生烟叶片，3次生物重复，对照组（亚硒酸钠还原菌培养基混合等体积40倍TMV汁液），3～5 d调查枯斑数，比较防治效果。

1.2.3  KBD-1纳米硒菌液对烟草常见病毒病的田间防治效果  制备50 L纳米硒合成菌液（硒含量为0.25 mg/L、菌浓度5×105 cfu/mL），制备TMV、CMV、PVY、TSWV侵染汁液。无毒K326烟苗设4个小区，标记1（TMV）、2（CMV）、3（PVY）、4（TSWV），小区间设保护行，每小区50株，5～6叶期接种。共5种处理：处理I，菌液与等体积40倍TMV病毒汁液混合15 min后接种;处理II，先喷菌液，2 h后接种病毒;处理III，先接毒，2 h后喷施菌液。处理PC：宁南霉素与等体积TMV病毒汁液混合作阳性对照;CK，灭菌亚硒酸钠还原菌培养基混合等体积TMV病毒作空白对照，每组处理10株烟苗。CMV、PVY、TSWV小区的处理方式与TMV一致，30 d后调查发病率，与空白对照相比计算防治效果。

1.2.4  KBD-1及其纳米硒菌液对烟株生长的影响  稀释KBD-1纳米硒菌液至单质硒含量为0.25 mg/L、菌浓度105 cfu/mL，K326生长至5～6片真叶，纳米硒合成活性菌液灌根处理，缓苗3 d后连续灌根2次，间隔时间3 d，每次每株10 mL，以荧光假单胞菌KBD-1菌液（菌浓度105 cfu/mL）、灭菌亚硒酸钠还原菌培养基灌根作为对照，重复3次。末次灌根3 d后调查鲜质量及最大叶长宽。

2  结  果

2.1  荧光假单胞菌分离鉴定及纳米硒合成菌液制备

经扫描电镜检测菌株形态（图1），确定分离到一株菌株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），命名为KBD-1。在活化KBD-1菌液中加入無色亚硒酸钠，发酵2～5 d后，可观察菌液中有红色物质出现（图2），结果暗示KBD-1可将无色亚硒酸钠还原成红色单质硒，命名该菌体KBD-1-Se。扫描电镜（图3）发现KBD-1样品外部存在高密度电子颗粒，继而对这些高密度电子颗粒进行EDS分析，在11.22 keV出现了硒的特征吸收峰，这与相关文献报道一致[19]，进一步确定KBD-1具有还原特性，可将亚硒酸钠还原生成红色单质硒。

2.2  KBD-1及KBD-1-Se菌液对烟草常见病毒基因表达的抑制作用

利用Real-time PCR和Western blot分别对KBD-1和KBD-1-Se处理烟草4种常见病毒的CP基因RNA相对表达量和CP蛋白相对表达量进行定量检测，结果（图4、5）显示， KBD-1与KBD-1-Se菌液均可显著减少TMV、CMV、PVY、TSWV四种病毒CP基因RNA相对表达量和CP蛋白相对表达量，且KBD-1-Se处理后TMV、CMV、PVY和TSWV四种病毒CP基因与CP蛋白的表达量的抑制效果均较KBD-1处理明显。以上结果进一步证明了KBD-1-Se对烟草RNA病毒具有较好的抑制效果，具有潜在的应用价值。

2.3  KBD-1及KBD-1-Se菌液对枯斑三生烟TMV室内防治效果

基于枯斑三生烟的半叶检测法测定，无论是KBD-1还是KBD-1-Se均对TMV具有显著抑制作用，结果如表2所示，KBD-1与KBD-1-Se对TMV防治效果分别为89.2%、95.5%，KBD-1-Se的钝化效率显著高于KBD-1。结果表明KBD-1纳米硒化后可增强原始菌株对TMV的抑制作用。

2.4  KBD-1-Se菌液对烟草常见病毒病的田间防治效果

为探究KBD-1-Se对烟草常见病毒病的防治效果，利用KBD-1-Se（5×105 cfu/mL）菌液对烟株和病毒进行处理，结果显示（表3）KBD-1-Se不同处理对TMV、CMV、PVY、TSWV均具有抑制作用。

菌液与病毒直接混合抑制效果最佳，防治效果均在88.0%以上，对CMV防效最高达91.4%;菌液喷施后接种病毒，防治效果在47.4%～70.5%之间;接种病毒后的菌液喷施，防效不足20.0%，未经菌液处理的植株发病率达到85.5%以上。以上结果表明菌液与病毒混合接种后，菌液具有良好的抑制作用，并具有预防效果。

2.5  KBD-1及KBD-1-Se菌液对烟株的促生作用

为验证KBD-1-Se对烟草的生长调控，连续3次灌施KBD-1-Se（单质硒含量0.25 mg/L，浓度5×105 cfu/mL）后，表4显示，K326烟株鲜质量及最大叶长宽均高于KBD-1菌液和CK处理，促生效果明显。

3  讨  论

在烟叶生产过程中，病毒消毒钝化和烟株促生催长是常见烟草病毒病防控途径，一是通过消毒和病毒钝化，降低病毒初始侵染源，二是在病毒侵染后，通过促生催长保证烟株正常生长发育，延缓病毒典型症状。本研究以生物钝化菌株KBD-1为主要研究材料，通过其自身的强还原性，将亚硒酸钠中的正四价硒还原成零价纳米硒，既可增强菌株自身的病毒钝化消毒活性，又能增加其对烟株促生催长，减弱烟草病毒病典型症状（矮缩、花叶、斑驳和坏死）。

在烟叶生产中，防控烟草病毒病的药剂主要有五大类[20]，包括寡糖类、多糖类、蛋白类、小分子化学物类和脂肪酸/醇类等，而利用生防菌株防治烟草病毒病研究和应用较少。荧光假单胞菌在真菌、细菌、线虫等方面的研究和应用有较多报道，不同分离株系对真菌脉冲病原菌镰刀菌（Fusarium spp.）、链格孢菌（Alternaria alternata）、稻瘟病菌（Macrophomina phaseolina）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、二孢白粉病菌（Erysiphe cichoracearum）[21-23]和细菌病原菌青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）[24]以及线虫类茄子根结线虫（Meloidogyne javanica）[25]等均表现出良好的防控效果。本论文研究的主要材料P. fluorescens KBD-1系从烟草病毒病重病田块健株根际土壤中筛选获得，不仅对烟草TMV病毒具有显著拮抗活性，同时还对烟草其他重要病毒（PVY、CMV和TSWV）也具有显著拮抗和症状修复功能。荧光假单胞菌作为抗病毒应用的首选菌株之一广阔的应用前景。

硒元素具有多种生物学功能，是一种调控生物机能的重要元素，但自然界多数硒以硒酸盐（Se6+）、亚硒酸盐（Se4+）存在，这些形态的硒具有一定生物毒性，且植物利用率低或难以利用。通常利用一些方法制备零价纳米硒，例如化学还原法、物理合成法，但是这些技术均存在污染环境、转化效率低、成本较高、对植物生长促生效果不显著等问题。而通过微生物合成来实现零价纳米硒制备的生物合成法是在绿色环保理念下发展起来的一种简单、安全、生物相容性好、环保和可回收的方式。微生物具有分布广、数量多、生命力强、适应性高和代谢产物多样的特点，利用微生物制备纳米硒取材便捷，成本低，更重要的是生物法合成的納米硒粒径小、热稳定性高[26]，如FESHARAKI等[27]研究微生物法合成纳米硒，选取肺炎克雷伯氏菌将硒的氯化物转化成纳米硒，制备的纳米硒粒径是10～550 nm，具有耐压性与耐高温性。本研究通过P. fluorescens KBD-1对亚硒酸钠进行了生物还原，使其在细菌菌体内形成零价纳米硒，在烟株抗病毒应用中，以菌液喷施和灌施施用，在制备和应用过程中，无任何废气、废液产生，具有显著环境友好的特点，有效解决了化学合成法污染严重和物理法所需设备条件要求较高的问题。

4  结  论

本研究系统揭示了P. fluorescens KBD-1不仅具有抗病毒拮抗活性，还具有强还原性，可将亚硒酸钠还原为纳米硒。相比较P. fluorescens KBD-1菌液，P. fluorescens KBD-1-Se菌液可增强原始菌株对烟草常见病毒的抑制效果和对烟株的促生作用。因此，纳米硒与生防菌的有机融合为生防菌株深度挖掘和利用提供了新思路，开拓了新路径，为烟草病毒病的绿色防治提供基础科研材料和数据支撑。

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