郭广君 朱雪梅 潘宝贵 刁卫平 刘金兵 高长洲 王述彬

摘要：  黃瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）是危害中国辣椒生产的第一大病毒，创制抗性育种材料、培育抗性品种是防治CMV最有效的方法。以高抗CMV材料PBC688为母本，与感病甜椒材料G29为父本杂交，通过连续自交获得F  6 代自交系。利用与抗性基因  qCmr2.1  紧密连锁的3个InDel分子标记，结合人工接种鉴定和农艺性状调查对109个株系进行筛选。分子标记鉴定结果显示，携带纯合抗性片段的株系有28个，携带纯合感病片段的株系有65个，携带杂合片段的株系有16个，杂合率为14.7%。农艺性状调查结果显示，大部分携带  qCmr2.1  基因的自交系果实较小，首花节位高，花期和成熟期显著晚于感病材料G29。筛选到1份高抗CMV且农艺性状优良的育种材料H  6 -223，人工接种鉴定结果显示，21个纯合抗病型对CMV表现为高抗、抗;在14个纯合感病型中，13个株系表现为感病，1个株系表现为中抗;9个杂合型株系的抗病性出现分离，表现为抗、中抗;3个在分子标记间出现重组的自交系中，H  6 -223表现为高抗，另外2个表现为中抗。由研究结果可以看出，3个InDel分子标记可以辅助创制辣椒抗CMV种质，创制的高抗CMV且农艺性状优良的种质H  6 -223可进一步用于辣椒抗CMV育种。

关键词：  辣椒; 黄瓜花叶病毒; 分子标记辅助选育

中图分类号：  S436.418.1 +2    文献标识码： A    文章编号：  1000-4440（2021）05-1251-11

Innovation of pepper germplasm resource with resistance to cucumber mosaic virus by InDel molecular marker assisted selection

GUO Guang-jun  1 ， ZHU Xue-mei  1，2 ， PAN Bao-gui  1 ， DIAO Wei-ping  1 ， LIU Jin-bing  1 ， GAO Chang-zhou  1 ，WANG Shu-bin  1

（1.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China; 2.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：  Cucumber mosaic virus （CMV） is the most serious virus threatening the production of pepper in China. Innovation of pepper germplasm resources and breeding varieties with resistance to CMV is the most effective method to prevent CMV. Using the resistant material PBC688 as female parent and the susceptible sweet pepper G29 as male parent， F  6  inbred lines were obtained through successive inbreeding in this study. Totally 109 F  6  inbred lines were identified by three InDel markers tightly linking to   qCmr2.1  . The pepper germplasms with resistance to CMV were chosen by combining with the artificial inoculation identification and the investigation of agronomic traits. The results of molecular marker identification showed that there were 28 lines carrying homozygous resistant fragment， 65 lines carrying homozygous susceptible fragment， and 16 lines carrying heterozygous fragments. The heterozygous rate was 14.7%. The investigation results of agronomic traits indicated that most inbred lines carrying   qCmr2.1   gene had smaller fruits， higher node position of the first flower， and significantly later flowering and ripening than susceptible material G29. A breeding material H  6 -223 with high resistance to CMV and excellent agronomic characters was screened. The results of artificial inoculation identification indicated that 21 disease-resistant materials with homozygous genotypes showed high resistance or resistance to CMV. The 13 lines with homozygous susceptible fragment were susceptible to CMV and one line was middle resistance to CMV. The resistance to CMV of nine lines with heterozygous genotypes was separated proportionally. Among the three inbred lines with recombinant molecular markers， H  6 -223 showed high resistance and the other two showed moderate resistance. In general， we established InDel molecular marker assisted selection system for pepper resistance to CMV， and innovated one germplasm H  6 -223 with resistance gene   qCmr2.1   and excellent agronomic traits， which could be applied in breeding for resistance to CMV in pepper.

Key words：  pepper; cucumber mosaic virus; molecular marker assisted selection

黃瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是世界十大植物病毒之一，可以侵染超过100个科的 1 200 种植物  [1] 。刘勇等  [2] 调查发现，从辣椒中检出的33种病毒中，CMV的检出率高达20.29%，超过烟草花叶病毒的检出率（14.64%）而成为危害中国辣椒生产的第一大优势病毒。在辣椒生产过程中，CMV不仅影响产量，而且危害果实品质，而培育抗性品种是防治CMV最经济、最有效的方法，也是中国辣椒抗病育种的主要目标。

国内外育种家通过抗性转育，已经育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品种，但高抗CMV的品种稀缺  [3] 。由于很多新CMV病毒株系可突破原有抗性，导致现有品种已无法满足产业需求  [4] 。鉴定和转育新的抗CMV基因或将多个抗性基因聚合，育成广谱、持久、高抗CMV的辣椒品种是解决高抗品种稀缺最有效的方法。目前，人们已经从辣椒上鉴定出30多个抗CMV相关的数量性状座位（Quantitative trait locus， QTL）和基因，除单显性基因  Cmr1  外，其他抗性基因均未得到转育应用  [5] 。

传统育种技术通过杂交和回交进行抗性基因转育，通过田间鉴定或人工接种鉴定进行抗性单株的筛选，耗时长、效率低。现代育种技术可以通过分子标记辅助选择（Marker assisted selection，MAS）技术实现抗性基因的快速积累  [6-7] 。近年来，高通量基因分型结合新一代测序技术可快速检测与抗病基因紧密连锁的单核苷酸多态性标记，大大缩短了高密度图谱构建、QTL位点分析和候选基因鉴定所需的时间  [8-10] 。随着分子标记开发技术的完善和标记类型的增多，越来越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技术在辣椒育种中的应用愈发广泛。Barka等  [11] 对辣椒上真菌、细菌、病毒和线虫等引起的相关病害的抗性基因连锁标记开发和抗性基因克隆进行了总结分析。李宁等  [12] 根据已有文献公布的抗病分子标记对209份辣椒资源进行了抗病基因检测，明确了供试种质的抗性基因。中国农业科学院蔬菜花卉研究所利用种间杂交、回交和分子标记辅助筛选技术创制出辣椒抗番茄斑萎病病毒的育种材料0516Tsw  [13] ，育成了首个抗番茄斑萎病病毒（TSWV）的甜椒品种中椒115号  [14] 。综上所述，采用分子标记辅助筛选技术能够快速鉴定种质资源的抗性基因，分子标记辅助回交可以提高抗性基因转育和抗病育种材料的创制效率，加快辣椒抗病育种的进程。

本课题组前期在辣椒抗源材料灌木状辣椒PBC688（ Capsicum frutescens  cv. PBC688）的2号染色体上定位到1个抗CMV的主效QTL（  qCmr2.1  ），并开发出3个与  qCmr2.1  紧密连锁的InDel分子标记  [15] 。抗源材料PBC688的果实极小，果实呈椭圆形，单果质量仅为1.0 g左右，在江苏地区侧枝多、首花节位高，花期和成熟期晚，无法直接用于抗CMV育种。感病材料 C.annuum  cv. G29坐果性好，果形为长灯笼形，单果质量约为50 g，首花节位低，花期和成熟期早，是一个优良的甜椒育种材料（图1）。据此，利用PBC688与G29进行种间杂交，将抗性基因  qCmr2.1  进行遗传转育，创制新的高抗CMV且农艺性状优良的种质材料。本研究利用上述3个InDel分子标记对创制的F  6 代自交系进行辅助筛选，结合人工接种鉴定和农艺性状调查，检验抗性基因的转育效率，以期筛选高抗CMV的育种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

母本材料为高抗CMV的 C.frutencens  cv.PBC688，父本材料为高感CMV的甜椒材料G29。2013年通过父母本种间杂交获得F  1 代杂种（图1），连续自交5代，2020年6月获得109个F  6 代高代自交系材料。每个自交系选取2株代表1个自交系的遗传信息，单株留种作为F  7 代，用于抗CMV效果的人工接种鉴定。

1.2 试验方法

2020年2-7月在江苏省农业科学院六合动物科学基地对F  6 代株系进行农艺性状调查和留种;4-6月在江苏省农业科学院蔬菜研究所实验室对F  6 代株系进行分子标记检测;8-10月在实验室用部分F  7 代株系进行抗CMV效果的人工接种鉴定。

1.2.1 DNA提取  基因组DAN提取使用DNA提取试剂盒（Cat#DP3112，北京百泰克生物技术有限公司产品），按照说明书要求逐步提取DNA。使用1%琼脂糖凝胶和Nano Drop One （Thermo Scientific）检测DNA的质量和质量浓度，调整DNA的质量浓度为40  ng/μl 。

1.2.2 InDel分子标记辅助筛选抗CMV基因  qCmr2.1    用于抗CMV基因辅助筛选的3对InDel分子标记的引物分别为InDel-  2-134  -F（5′-TGCTTCAGTTGAGTTGTCCA-3′）+InDel-  2-134  -R（5′-TAAATCCCCTTGTGGTGGCT-3′）、InDel-  2-140  -F（5′-GGTTGGTTAGCATGGGTGTG-3′）+InDel-  2-140  -R（5′-CGAAACCGAACCGTTAAAGAC-3′）、InDel-  2-151  -F（5′-ACCCACGACTTAAACTCAAAACT-3′）+InDel-  2-151  -R（5′-TCAAGAGAGAAATAGTGATGCCA-3′）。

PCR扩增：扩增体系为20.0 μl，包含2.0 μl DNA模板、10.0 μl  2× TSINGKEMaster Mix、各0.4 μl上下游引物，补充ddH  2 O至总体积为20.0 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。将扩增产物于4 ℃保存。PCR产物检测：用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测PCR扩增产物。电泳结束后，用银染法染色，观察并记录扩增结果。

1.2.3 F  6 代自交系果实性状的调查  参照《辣椒种质资源描述规范和数据标准》  [16]  对F  6 代自交系的果实性状进行调查。

1.2.4 人工接种CMV鉴定F  7 代自交系对CMV的抗性  2020年7月选择父母本材料和47个F  7 代自交系育苗，待4叶1心时用于人工接种CMV。接种方法参照姚敏等  [17] 建立的CMV侵染性克隆法，在农杆菌的介导下进行侵染，并根据实际需求进行改进。构建在pCB301-2×35S-MCS-HDV  RZ -NOS植物表达载体上的CMV侵染性克隆由南京农业大学陶小荣老师提供。高抗CMV的父本PBC688为抗性对照，易感CMV的母本G29为感病对照。每个F  7 代株系人工接种25株，5株接种蒸馏水，5株接种空白载体，15株接种CMV侵染性克隆。

2 结果与分析

2.1 InDel分子标记辅助筛选抗CMV基因  qCmr2.1

本研究利用3个与抗CMV基因  qCmr2.1  紧密连锁的InDel分子标记对109个F  6 代自交系进行抗性基因筛选。InDel-  2-134  和InDel-  2-151  为侧翼分子标记，InDel-  2-140  为中间分子标记，InDel-  2-140  与抗性基因连锁最为紧密。由图2可以看出，InDel-  2-134  在部分株系的扩增条带为230 bp，与高抗CMV材料PBC688一致;在部分株系的扩增条带为211 bp，与感CMV材料G29一致;在部分株系的扩增条带为杂合状态。InDel-  2-140  在部分株系的扩增条带为168 bp，与PBC688一致;在部分株系的扩增条带与G29一致，为178 bp;在部分株系为杂合型。InDel-  2-151  在抗CMV株系中的扩增条带为100 bp，在感CMV株系中的扩增条带为107 bp;在部分株系表现为杂合。通过统计分析发现，在109个自交系中，28个自交系的扩增条带与高抗CMV材料PBC688完全一致;65个自交系的扩增条带与感CMV材料G29完全一致;16个自交系表现为杂合型。在16个杂合自交系中，标记间出现重组的自交系有3个。自交系H  6 -92、H  6 -210中间标记为杂合型，侧翼标记分别为纯合感病型、纯合抗病型;自交系H  6 -223侧翼标记为杂合型，中间标记为纯合抗病型（表1）。上述结果显示，经过1次种间杂交和5次自交后，3个标记的纯合率达到85.3%，其中感病自交系的纯合率为59.6%，抗病自交系的纯合率为25.7%，杂合率为14.7%，重组率为2.8%。

2.2 F  6 高代自交系的果实性状

由于F  6 代自交系的父母本分别来自 C.frutencens 和 C.annuum ，种间杂交导致后代群体存在不育材料，所以F  6 代群体只有109个自交系。农艺性状调查结果显示，109个自交系的果形分离显著，包括与父本类似的椭圆形小果、与母本相似的长灯笼形甜椒以及父母本中间类型的锥形、羊角形、指形等多种类型（图3）。单果质量为 0.63～ 52.23 g，部分材料表现出超亲遗传，其中3个自交系的单果质量小于父本材料，6个自交系的单果质量超过母本材料。结合分子标记鉴定结果分析发现，携带纯合或杂合抗病基因的自交系材料单果质量偏小，均未超过20.00 g。其中H  6 -243为纯合抗CMV材料，呈长灯笼形，单果质量为19.83 g，约为母本材料的50%。17个形状为长灯笼形且单果质量超过20.00 g的自交系均携带纯合感病基因（表1）。在3个标记间发生重组的自交系材料H  6 -92的果实与母本类似，呈长灯笼形，单果质量为7.00 g;H  6 -210果实呈短锥形，单果质量仅为4.00 g;H  6 -223果实呈羊角形，单果质量为18.77 g，果实纵径为8.93，果实横径为3.27 cm，首花节位低，连续坐果率高，整株果实数量为63个（图4）。综上可见，H  6 -223是为数不多的携带抗性基因且农艺性状优良的材料，可进一步用于抗CMV育种。

2.3 F  7 代自交系對CMV的抗性

InDel-  2-134  、InDel-  2-140  和InDel-  2-151  这3个分子标记，本研究选择的47个F  7 代自交系包括21个与抗病材料PBC688一致的自交系、14个与感病材料G29一致的自交系、9个杂合状态自交系、3个在InDel分子标记间发生重组的自交系。由表2可以看出，21个与PBC688的3个InDel分子标记一致的自交系的平均病情指数为8.18，其中5个株系表现为高抗，16个株系表现为抗;14个与G29 3个InDel分子标记一致的自交系的平均病情指数为49.95，其中13个株系表现为感病，1个株系表现为中抗;9个杂合自交系的平均病情指数为21.07，其中4个株系表现为抗，5个株系表现为中抗，同一株系内不同单株对CMV的抗性出现分离;3个分子标记间发生重组的自交系的平均病情指数为20.25，其中2个株系表现为中抗，1个表现为高抗。高抗株系H  6 -223在InDel-  2-140  标记处的基因型与抗性材料PBC688一致，两翼标记为杂合状态，其H  7 代的病情指数为1.48。由以上结果可以看出，人工接种鉴定结果与分子标记鉴定结果具有很高的一致性。结合分子标记鉴定、果实性状调查和人工接种鉴定结果可以看出，H  6 -223同时具有高抗CMV和优良农艺性状，是一份优异的抗CMV育种材料。

3 讨 论

黄瓜花叶病毒为世界十大植物病毒之一，可侵染果树、蔬菜和观赏植物等100多个科的1 200多种植物，其中茄科蔬菜，特别是辣椒、番茄极易受CMV侵染  [18] 。在中国，抗CMV育种一直是辣椒抗病育种的主要目标之一，但CMV病毒株系类型多、变异快、重组频繁、传播媒介多、寄主范围广，而高抗CMV辣椒资源稀缺、抗性机制复杂、抗性基因在转育过程中易丢失，以上原因导致目前生产上推广的辣椒品种不能满足抗CMV的需求  [3] 。鉴定和应用新的抗CMV基因或将多个抗性基因聚合，育成广谱、持久、高抗CMV的辣椒品种是解决高抗CMV品种稀缺最有效的方法  [19] 。

目前，人们已经从辣椒上鉴定出30多个抗CMV相关的QTL和基因，除显性基因  Cmr1  外，其他抗性基因均未得到转育应用，根本原因在于抗性基因和抗性机制尚不清晰  [3] 。笔者所在课题组在 C. frutescens  cv. PBC688的2号染色体上定位到1个抗CMV的主效QTL（  qCmr2.1  ），预测的候选基因  Ca02g19570  与拟南芥中抗CMV基因  RCY1  同属于NBS-LRR家族基因，经基因表达模式分析和病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术验证，明确了  Ca02g19570  是辣椒抗CMV的抗性基因，与其紧密连锁的InDel标记可用于辣椒抗CMV的辅助筛选  [15， 20] 。

本研究通过3个与  qCmr2.1  紧密连锁的InDel标记分析显示，F  6 代自交系3个InDel分子标记的纯合率为85.3%，其中感病自交系的纯合率为59.6%，抗病自交系的纯合率为25.7%，杂合率为14.7%。这一结果说明，经过1代种间杂交和5代自交，F  6 代自交系材料不能达到完全纯合的状态。王立浩等  [13] 研究发现，经过1次杂交和5次回交，果实的大小和单果质量快速提高，但方差较大，说明群体内基因尚未纯合。郭聚领等  [21] 利用重测序技术和生物信息学相结合的方法对甘蓝型油菜BC  3 F  3 世代中选单株进行背景分析发现，背景回复率不能完全纯合，中选单株的背景回复率较高的2个单株的背景回复率分别为97.93%和98.18%。前期未经过分子标记辅助筛选，F  6 代纯合抗病材料比例显著低于纯合感病材料，笔者猜测其原因可能是父母本分别为 C. frutencens 和 C. annuum ，种间杂交导致后代群体存在不育材料，而抗性基因与不良农艺性状连锁遗传，导致携带抗性基因的株系不育率更高。卢倩倩等  [22] 利用白菜抗根肿病基因连锁标记对F  2 代单株进行分子标记辅助筛选，同样发现携带纯合抗病基因的植株偏少。

109个自交系中在3个分子标记间发生重组的自交系为3个，重组率为2.8%，说明在抗性基因转育过程中，基因间重组效率低，会导致不良农艺性状的连锁累赘。在本研究中，通过农艺性状调查发现，携带纯合或杂合抗病基因的自交系果实较小，首花节位高，花期、成熟期显著晚于母本材料。研究还发现，首花节位、花期及成熟期这3个与果实成熟相关的性状有6个显著关联的单核苷酸多态性（SNP）定位到了2号染色体的 154 815 667～  155 002 754  bp区域  [23] 。本研究所用3个分子标记的物理区间为 152 845 012～  153 206 189  bp，与果实成熟相关性状的定位区间毗邻，它们之间很有可能连锁遗传，最终导致首花节位高以及花期和成熟期晚。祝光涛  [24] 通过比较栽培种番茄和野生番茄基因组的相似性发现，抗病基因在栽培种中的应用导致较大外源DNA片段的渗入，而这些长DNA片段在栽培种中的渗入可能会产生严重的连锁累赘。在小麦抗赤霉病育种过程中，丰产性与赤霉病抗性之间的矛盾是小麦育种的世界性难题  [25-27] 。综上，在抗病基因转育过程中需要综合利用分子标记辅助选择和常规育种策略，从而创制出抗病性强、综合农艺性状优良的育种材料，才能更好地推进抗病品种选育。

本研究通过人工接种CMV鉴定F  7 代自交系对CMV的抗性显示，3个InDel分子標记与感病材料G29一致的14个自交系的平均病情指数为49.95，其中13个株系表现为感病，1个株系表现为中抗;3个InDel分子标记与抗病材料PBC688一致的21个自交系的平均病情指数为8.18，其中高抗株系5个，抗病株系16个;而杂合基因型的株系单株抗性出现了分离，当自交系的中间分子标记InDel-  2-140  与抗病材料PBC688一致时，后代单株均表现出抗病。以上结果表明，人工接种鉴定结果与分子标记鉴定结果基本吻合，中间分子标记InDel-  2-140  与抗性基因  qCmr2.1  的连锁最为紧密，筛选准确度最高。苏晓梅  [28] 通过基因型分析发现，F  2 群体中具有纯合抗病基因型的为12株，而人工选育的单株中具有纯合抗病基因型的为3株，这一结果说明，传统的田间选择方法降低了目标基因（纯合抗病）入选率，而利用分子标记筛选可以防止目标基因丢失。郭聚领等  [21] 利用与油酸含量性状基因连锁的InDel分子标记辅助选择高油酸含量的甘蓝型油菜，结果显示，改良材料的种子油酸含量明显高于轮回亲本且差异极显著，说明利用分子标记辅助选择进行油酸含量改良是可行的。以上研究结果表明，利用分子标记进行目的基因的辅助选择效率更高，可以有效地应用于植物育种。

综上所述，本研究以高抗CMV种质PBC688为母本和感病甜椒品种G29为父本，通过种间杂交和连续自交获得了F  6 代自交系，辅以InDel分子标记筛选结合农艺性状调查和人工接种鉴定，建立了辣椒抗CMV分子标记辅助筛选体系，并创制出1份高抗CMV且农艺性状优良的自交系材料H  6 -223，可用于后续的辣椒抗CMV育种。

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（责任编辑：徐 艳）