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GM-CSF 对猪卵丘细胞扩展相关基因表达的影响

2021-11-13黄国梁王倩玉买雨晨咸承俊张涛杰

现代畜牧兽医 2021年10期
关键词:卵丘储液卵母细胞

黄国梁,王倩玉,买雨晨,咸承俊,张涛杰

(西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730124)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种分子量为18~22 kDa 的糖蛋白,通过与其受体GM-CSFR 相结合发挥功能。GM-CSF是主要的造血生长因子之一,在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF 通过调控粒细胞、单核巨噬细胞以及激活树突状细胞,在外周组织中发挥功能[1],也能够刺激骨髓细胞生成粒细胞以及巨噬细胞、T 细胞等免疫细胞的增殖[2]。1994 年,Brannstrom等[3]发现,大鼠卵巢能分泌具有生物活性的GM-CSF,分泌水平在排卵时达到峰值。1996年,Jasper等[4]发现,人类卵泡液中的GM-CSF随着生殖周期的变化而改变,体外培养的颗粒性黄体细胞和卵泡膜性黄体细胞均分泌GM-CSF,表达为其受体GM-CSFRα 和β。在GM-CSF 敲除小鼠的卵巢功能研究中发现,与正常小鼠相比,双敲(GM-/-)妊娠小鼠卵巢中细胞数明显减少,孕酮表达水平降低,表示GM-CSF 影响早期妊娠双敲小鼠(GM-/-)黄体的分泌功能,但不影响卵巢正常功能的发挥[5]。

有研究表明,子宫上皮细胞能够分泌GM-CSF,原位杂交结果证明了子宫内膜上皮和腺上皮是GM-CSF 表达的主要部位。卵巢分泌的生殖激素对GM-CSF 有调节作用,这种雌激素诱导的分泌增加可以通过联合使用孕酮来抑制[6]。在牛的整个发情周期中,输卵管和子宫内膜都可见GM-CSF的表达。可见,GM-CSF是调节胚胎发育的一个重要细胞因子[7]。与正常体型牛相比,GM-CSF 在肥胖牛的输卵管壶腹部的表达较低,可能与其生产的优质胚胎数量较少有关[8]。还有研究发现,在发情周期和妊娠早期的小鼠子宫内膜上皮分泌的GM-CSF,是类固醇激素调节子宫内中性粒细胞、巨噬细胞的激活和募集的重要调控因子[9]。GM-CSF 能够促进小鼠附植前胚胎的发育和存活,可能与其对细胞应激反应和凋亡通路的抑制作用有关[10]。猪胚胎发育过程中,培养基添加2 μg/L 或10 μg/L 的GM-CSF,体外受精与核移植胚胎的囊胚率和囊胚细胞数量均明显增加,在囊胚期移植后经过GM-CSF处理的胚胎可成功进行核移植[11]。GM-CSF受体α和β在牛的卵丘细胞和卵母细胞上均有表达,可提高卵丘细胞扩展率[12]。试验旨在研究猪卵母细胞体外培养过程中,GM-CSF对卵母细胞的极体排出率、卵丘细胞的扩展率的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

重组GM-CSF(北京中科拜克生物技术有限公司)、M199 培养基(GIBCO)、CCK-8 检测试剂盒(日本同仁)、M199基础培养液(Biosharp)。

1.2 药品配制

捡卵液(M199 基础培养液28 mL+200 μL 肝素钠储液),洗卵液(M199基础培养液2 mL+胎牛血清100 μL,试验前2 h配好放入恒温箱平衡)

成熟培养液配制:M199 基础培养液730 μL+双抗(100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 硫酸链霉素)+10 μL 葡萄糖储液(0.55 g/mL)+10 μL NaHCO3储液(0.03 g/mL)(SIGMA V900182)+10 μL 丙酮酸钠储液(0.03 g/mL)(EKEAR SO131)+10 μL PVA 储液(0.01 g/mL)(EKEAR P0207)+l-半胱氨酸储液(0.07 g/mL)(SIGMA c7352-100G)+4%胎牛血清(Biosharp)

试验前2 h 配好放入恒温箱平衡。试验开始前添加10 IU/mL PMSG(北京索莱宝科技有限公司)+10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素HCG(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 卵母细胞体外培养

1.3.1 卵母细胞的收集

猪卵巢无菌采集于兰州市榆中县生猪屠宰场,选择9 头6~7 月龄健康长白猪卵巢,将采集到的卵巢保存于PBS缓冲液中,2 h内带回实验室。37 ℃恒温捡卵,选择胞质均匀、颜色较深、颗粒细胞包裹紧密、达3 层以上的COC,在洗卵液、成熟液中各冲洗2次备用[13]。

1.3.2 成熟液的分组

将获取的猪卵泡卵母细胞置于35 mm胚胎培养皿中,做成3个200 μL的微滴,随后覆盖石蜡油。每个液滴中放入30~40个卵母细胞,每皿1组,随机分为3组,每组3个试验重复。试验组1 为成熟培养液;试验组2 为成熟培养液中添加10 μg/L 的GM-CSF;试验组3 为成熟培养液中添加100 μg/L的GM-CSF。

1.3.3 卵母细胞成熟培养

洗涤后的卵母细胞放入38 ℃、5%CO2饱和温度条件培养48 h,进行机体排出率和卵丘扩展情况的统计,并收集卵丘细胞进行检测。

1.4 试验方法

按照CCK8 检测试剂盒说明,将在成熟培养液中培养12、24 及48 h 的COC 上的卵丘细胞吹下,接种于96 孔板中。每孔加入100 μL 的卵丘细胞至含4%胎牛血清的培养液中,在二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h后加入10 μL CCK8 检测试剂,培养箱中孵育2 h 至培养液显色为粉红色,并设空白对照组,在酶标仪中检测OD 值。OD 值按照试剂盒提供的细胞活力计算方法进行计算并统计。

1.5 数据统计与分析

采用Graph Pad Prism 8 软件进行差异显著性分析和制图,基因表达与蛋白表达的组间差异性分析采用t检验,各级卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率统计采用单因素方差分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞判定(见图1)

图1 卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞形态Fig.1 Scale of cumulus cell expansion and morphology of mature oocytes

倒置显微镜下将卵母细胞的按卵丘扩展程度进行分类。由图1(a)可知,0 级为卵母细胞的卵丘细胞脱落退化;由图1(b)可知,1 级为卵母细胞的卵丘细胞只有一层或最外围扩散,卵丘细胞少且不均匀;由图1(c)可知,2 级为卵母细胞的卵丘细胞的外层出现扩散,层数增多,卵丘细胞包裹紧密颜色深;由图1(d)可知,3 级为卵母细胞的卵丘细胞除放射冠外开始全部扩散,卵丘细胞颜色较浅,胞质均匀;由图1(e)可知,4 级为卵母细胞的卵丘细胞全部扩散;由图1(f)可知,吹打下卵丘细胞,观察成熟卵母细胞,卵黄间隙上出现极体即可判定为成熟。

2.2 GM-CSF 对卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟的影响(见表1)

由表1 可知,卵丘扩展程度为3~4 级的卵丘细胞百分数在各组别间差异性显著(P<0.05)。

表1 卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率Tab.1 Cumulus cell expansion and oocyte polar body excretion rate 单位:%

2.3 GM-CSF对卵丘细胞活性的影响(见图2)

图2 GM-CSF对卵丘细胞活性的影响(n=3)Fig.2 Effect of GM-CSF on cumulus cell activity(n=3)

将含有不同浓度GM-CSF 的COC 培养12、24、48 h后,放入0.2%透明质酸的M199 培养液中,于培养箱中孵育5 min,使用10 μL 移液枪轻轻吹打COC。将脱落下来的卵丘细胞1 500 r/min 离心收集,加入4%胎牛血清后均匀注入96孔板中培养24 h,再加入CCK-8进行活性检测,每组试验均设3 个重复。由图2 可知,不同培养时间的GM-CSF 组细胞活性均高于对照组,且48 h 时,10、100 μg/L 的GM-CSF 组细胞活性极显著高于对照组(P<0.01)。

3 讨论

通过组织学定位发现,GM-CSF受体在牛卵巢中可与颗粒细胞孕酮分泌的相关蛋白3β-HSD 及卵泡刺激素FSHR 在牛卵巢中共表达,暗示其可能对颗粒细胞的激素分泌功能有影响。体外培养卵巢颗粒细胞中,添加GMCSF可以增加颗粒细胞2-脱氧葡萄糖(DOG)或3-O-甲基葡萄糖(OMG)的吸收,暗示其可调节牛卵巢颗粒细胞糖代谢的活性[11]。在关于牛卵丘细胞的研究中发现,体外培养的卵母细胞在SOF培养基中添加0、1、10和100 μL的人重组GM-CSF,22 h后分析扩展指数(CEI)和极体排出率,发现GM-CSF 受体在卵丘细胞和卵母细胞中均出现,10 μg/L 和100 μg/L 组扩展指数为0.8 和1.22,高于0.22 的对照组。但极体排出率没有明显差异。100 μg/L 组的卵丘细胞生存率比对照组高出20%,且差异极显著。且10 μg/L 和100 μg/L 增加卵丘细胞数量分别为20%和50%。而GM-CSF特异性抑制剂IP3细胞因子对以上差异均有抑制作用[13]。GM-CSF 对体外培养卵丘细胞和卵母细胞的代谢有显著影响[14]。

文献报道,排卵前卵泡及多囊卵泡综合征患者卵泡液中均含有GM-CSF[4,15-16]。试验在未添加猪卵泡液(PFF)的情况下,10 μg/L 组与100 μg/L 组的GM-CSF 对卵丘细胞扩展均具有明显的促进作用,且主要提高扩展程度较高的3~4 级卵丘细胞,对扩展程度较低的0~2 级卵丘细胞的扩展无明显作用,说明GM-CSF 对卵丘细胞的扩展与COC 的自身状态有关,即GM-CSF 能促进质量较好的COC 的卵丘细胞扩展,但不能逆转质量较差的卵丘扩展。GM-CSF 虽然能提高3~4级卵丘细胞的扩展数,但对极体排出及卵母细胞成熟率无显著影响。孙兴参等[17]研究猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟的关系,发现卵丘细胞扩展充分与否与卵母细胞核成熟无显著相关,在去除卵母细胞的COC 中,卵丘细胞的扩展不受卵母细胞的影响,说明卵丘细胞扩展与否并不对卵母细胞成熟起决定作用,GM-CSF对卵母细胞成熟没有显著促进作用,与Oscar 等[12]在牛卵丘细胞扩展中得出的结论一致。

本试验中,分别对COC 中GM-CSF 孵育12、24、48 h的卵丘细胞的细胞活性进行检测,结果表明,3个时间段的细胞活性在10 μg/L 组与100 μg/L 组均有所提高,作用48 h后的细胞活性组间差异显著(P<0.05)。

4 结论

GM-CSF 能够显著提高3~4 级猪卵丘细胞扩展率及卵丘细胞的活性。

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