郭家俊，申 瑾，陈 翔，陈 乐，尚彬玲，章 中

（宁夏大学 食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

芽孢是某些细菌在不利于生长繁殖的条件下形成的休眠体，具有极端抗逆性。在食品杀菌过程中，芽孢是最难被杀灭的对象，由于杀菌强度不够，芽孢导致的食品腐败和食物中毒事件时有发生[1-4]。常温常压下芽孢内膜具有极端不通透性，水分子都难以自由通过，这种通透屏障是芽孢难以被杀灭的原因之一。研究表明，芽孢内膜受损，水分子穿透芽孢内膜屏障并进入芽孢内核是杀灭芽孢的重要原因之一[5-8]。水分子跨膜运输的主要方式为自由扩散，芽孢内膜对水分子的通透性与内膜流动性直接相关，因此研究芽孢内膜流动性十分重要[9]。

热能够提高磷脂分子的侧向热运动，改变细胞膜磷脂间氢键作用的强弱及膜磷脂的相态，宏观表现为芽孢内膜流动性的增强，因此热是影响芽孢内膜流动性的重要原因之一[10-11]。乙醇具有一定的杀菌效果，乙醇分子也会对芽孢内膜产生影响。将热与乙醇结合，预期能够提高杀灭芽孢的效果，在食品工业中具有一定的应用价值。

作者采用平板计数法、荧光偏振法、分光光度法和流式细胞术，通过对芽孢存活率、荧光偏振度、OD600值及芽孢内膜通透性的测定，研究了热结合乙醇对枯草杆菌芽孢内膜通透性和芽孢杀灭效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），编号As 1.433；营养琼脂：天津市大茂化学试剂厂；硫酸锰：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；DPH：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；碘化丙啶（PI）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DSX-280B型高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；722型可见分光光度计：上海驰唐电子有限公司；TGL-10B型离心机：上海安亭科学仪器厂；电子恒温不锈钢水浴锅：上海宜昌仪器纱筛厂；F-7000荧光分光光度计：日立 （日本）有限公司；CyFlow Cube 8流式细胞仪：日本SYSMEX（希森美康）株式会社。

1.3 方法

1.3.1 枯草杆菌芽孢菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌（As 1.433）菌种在营养琼脂培养基活化后，划线接种到试管斜面促芽孢生长培养基上，在37℃培养7 d，洗涤离心3次后，菌悬液浓度大约调整在1.5×109CFU/mL 左右，4 ℃保存[12]。

1.3.2 DPH的配制 将DPH溶液的浓度配制为2×10-3mol/L（以四氢呋喃为溶剂），在4℃下棕色瓶中密闭保存，使用前用0.02 mol/L PBS缓冲液（pH 6.8）将储备液稀释至所需要的浓度[12]。

1.3.3 DPH标记芽孢内膜 DPH标记芽孢内膜参照钱静亚[13]等的方法并进行了优化。取8 mL芽孢悬浮液，离心，用PBS缓冲液洗涤1次后离心弃上清液，加入8 mL浓度为3×10-6mol/L的DPH溶液，在50℃下水浴30 min，再用PBS缓冲液洗涤2次，离心后将芽孢在PBS缓冲液中的浓度调整为1×106～1×107CFU/mL。

1.3.4 热结合乙醇处理芽孢悬浮液 取标记后的芽孢悬浮液，离心弃上清液，分别加入体积分数30%、75%的乙醇溶液，在60、80℃下处理20 min。

1.3.5 芽孢悬浮液荧光偏振度的测定 标记后的芽孢悬浮液在360 nm激发波长和430 nm发射波长下，采用激发与发射缝宽10 nm，测定垂直荧光强度和水平荧光强度，计算荧光偏振度P，计算公式为：

式中：IVV为起偏器和检偏器光轴同为垂直方向时测得的荧光强度；IVH为起偏器光轴为垂直方向和检偏器光轴为水平方向时测得的荧光强度；G为光栅校正因子；IHV为起偏器光轴为水平方向和检偏器光轴为垂直方向时测得的荧光强度；IHH为起偏器和检偏器光轴同为水平方向时测得的荧光强度。

荧光偏振度P值越小，流动性越大，反之则相反。

1.3.6 枯草芽孢杆菌的平板计数 将处理前后的芽孢悬浮液梯度稀释，吸取1 mL稀释液加入平板中，再倒入15～20 mL培养基混匀，待凝固后在 37℃下倒置培养24～48 h，计算菌落总数对数值。

1.3.7 芽孢悬浮液OD600值的测定 取处理后的枯草杆菌芽孢悬浮液，测定600 nm处的吸光值，根据吸光值变化检验芽孢萌发情况。

1.3.8 流式细胞仪检测枯草杆菌芽孢内膜通透性取处理前后的枯草杆菌芽孢悬浮液，将菌液浓度稀释到 106～107CFU/mL。 用 PI（Propidium iodide，碘化丙啶）染色后，用流式细胞仪检测前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）、荧光通道 FL2 和 FL3[14]。数据采集后用FSC Express Version 3.0软件（De Novo software，Canada）分析。

1.3.9 统计分析 所有的实验重复3次，数据通过SPSS 17.0进行分析，采用Origin 2018软件作图，以不同字母标注显著差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢的杀灭作用

如图1所示，与对照相比，80、60℃结合体积分数30%乙醇处理后，芽孢存活率下降约0.12个对数。60℃结合75%乙醇与80℃结合75%乙醇处理，都使芽孢存活率下降0.23个对数。可以看出，80℃结合75%乙醇处理对芽孢有最好的杀灭效果，芽孢存活率下降了1个对数。热结合乙醇对芽孢有显著的杀灭效果。为解释这一实验结果，对热结合乙醇处理后芽孢悬浮液的荧光偏振度、OD600值及芽孢内膜通透性进行研究。

图1 热结合乙醇处理后枯草杆菌芽孢存活浓度的变化Fig.1 Change of survival concentration of Bacillus subtilis spores after heat treatment combined with ethanol

2.2 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢悬浮液荧光偏振度的影响

DPH是一种较为敏感的荧光探针，能够插入到磷脂双分子层中，在不同条件下，磷脂的活动的变化会导致荧光偏振度的改变，宏观表现为膜流动性的变化[15-17]。热结合乙醇处理后，芽孢悬浮液荧光偏振度见图2。与对照相比，80、60℃结合体积分数30%乙醇和80℃结合30%乙醇处理后，荧光偏振度显著下降，芽孢内膜流动性显著上升（P＜0.05），但3种处理之间没有显著差异（P＞0.05）。60、80℃结合75%乙醇处理后，芽孢悬浮液荧光偏振度下降更为显著。从结果可以看出，热结合乙醇处理时，乙醇体积分数对芽孢内膜流动性的改变至关重要。热能够提高磷脂分子的侧向热运动，改变膜脂的相态，宏观表现为芽孢内膜流动性的增强[9-10]，这在文献[14]的研究中也有过报道。磷脂的醇溶性质也会对芽孢内膜流动性产生重要影响，内膜流动性的增强使其通透性提高，水分子更易进入到芽孢内部，从而杀灭芽孢。

图2 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢悬浮液荧光偏振度的影响Fig.2 Effect of heat treatment combined with ethanol on fluorescence polarization of suspension of Bacillus subtilis spores

2.3 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢悬浮液OD600值的影响

芽孢内膜通透性的改变，会使芽孢内的物质更容易释放出来，芽孢悬浮液的OD600值可以用来估计芽孢内容物的释放情况。当芽孢内容物释放后，芽孢悬浮液的折光性会发生变化，OD600值降低[18-19]。热结合乙醇处理后，芽孢悬浮液OD600值变化见图3。80、60℃结合30%乙醇和80℃结合30%乙醇处理后，芽孢悬浮液 OD600值显著下降（P＜0.05），但 3 种条件下的OD600值之间差异不明显（P＞0.05）。热结合75%乙醇处理后的OD600值显著低于热结合30%乙醇处理 （P＜0.05），80℃结合75%乙醇处理后的OD600值下降最多。热结合乙醇处理下，温度越高、乙醇体积分数越高，芽孢内膜通透性变化越大，OD600值下降程度越大，内容物释放程度越高。

图3 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢悬浮液OD600值的影响Fig.3 Effect of heat treatment combined with ethanol on OD600value of suspension of Bacillus subtilis spores

2.4 热结合乙醇处理后枯草杆菌芽孢内膜通透性的变化

进一步采用流式细胞术对芽孢内膜通透性进行研究。PI可以透过受损细胞膜与内部DNA结合后发出强烈红色荧光。将热结合乙醇处理后的芽孢用PI进行染色，流式细胞仪检测后的结果见图4。与对照相比，80℃处理后芽孢内膜通透性发生了改变，阳性区域变化为34.78%；60℃结合30%、75%乙醇处理后，阳性区域变化分别为68.50%和78.73%；80℃结合30%、75%乙醇处理后，阳性区域变化为71.44%和93.69%。热结合乙醇处理后，芽孢内膜通透性显著提高，80℃结合75%乙醇处理后，芽孢内膜通透性变化最大，表明热结合乙醇处理的过程中，温度及乙醇体积分数越高，芽孢内膜通透性越强。

图4 热结合乙醇处理对枯草杆菌芽孢内膜通透性的影响Fig.4 Effect of heat treatment combined with ethanol on the permeability of spore inner membrane

热结合乙醇处理后，芽孢内膜流动性、芽孢悬浮液OD600值及芽孢流式细胞仪检测结果是一致的，均表明热结合乙醇处理条件下芽孢死亡和芽孢内膜通透性的变化相关。

3 结 语

热结合高体积分数乙醇处理能够对芽孢产生杀灭效果，在食品工业中具有一定的应用价值。80℃结合75%乙醇处理后，芽孢存活率下降了约1个对数值。热结合乙醇能够使芽孢内膜流动性增强，60、80℃结合75%乙醇处理使芽孢内膜流动性大幅增加。热结合乙醇处理后，芽孢悬浮液OD600值都呈现下降趋势，说明芽孢内膜通透性提高，芽孢内容物更容易释放出来，80℃结合75%乙醇处理后，OD600值下降程度最大。流式细胞术结果显示，80℃结合75%乙醇处理后，芽孢内膜通透性变化最大，阳性区域变化为93.69%。结果表明，热结合乙醇处理对芽孢的杀灭效果与芽孢内膜通透性的变化密切相关，芽孢内膜通透性的增大是芽孢死亡的重要原因之一。