谢迎春，李拥军，苏玲玉，侯言东，骆 姗，张 琳

（1.甘肃省疾病预防控制中心，甘肃兰州 730000；2.甘南州疾病预防控制中心，甘肃合作 747000）

红2G ，又名食品红10或酸性红1，CAS号3734-67-6，国际编码E128，属于偶氮类合成色素，其颜色呈浅红色，可在食物原有色泽基础上添上桃红色，甚至更深的血红色，目前已有报道[1]测定红2G的主要方法有高效液相色谱法（HPLC）[2-4]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS）[5-7]，由于该物质被人体摄入后能够分解出致癌物质苯胺，可能诱发癌症，所以在亚洲、欧洲[8]等地区的很多国家已经明确规定禁止在食品中使用。但是在我国海关以及市面上发现依然有部分食品中违规添加红2G的现象[9]，为更加精准地判定检测结果，需要借助不确定度对其检测过程中系统效应和随机效应进行修正。

测量不确定度是实验室中质量控制的需要，能有效降低实验过程中的风险因素，还可以反映结果正确性的可疑度，提高分析结果质量和准确性，已普遍用于国内外各类分析方法中[10-14]。根据目前有关红2G的评估研究，还没有发现对HPLC法测定熟肉制品中红2G含量进行不确定度评定的报道。本研究参考CNAS-GL006-2019[15]、JJF 1059.1—2012[16]和JJF 1135—2005，对高效液相色谱法测定熟肉制品中红2G含量的整体实验过程进行不确定度评定，建立科学合理的数学模型，对实验过程中不确定度来源进行分析，提高检验结果的准确性和科学性，为质量控制提供可靠依据。

1 材料和方法

1.1 试剂材料

Acid red 2G（含量90%，不确定度：0.5%，BePure公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；亚铁氰化钾、乙酸锌、乙醇、氨水、石油醚、柠檬酸、聚酰胺粉（200～400目）和乙酸铵（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；海砂（化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 仪器设备

安捷伦1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ME204E电子天平（感量0.1 mg，梅特勒-托利多仪器公司）；AB135-S电子天平（感量1 mg，梅特勒-托利多仪器公司）；3-30KS高速冷冻离心机（Sigma仪器公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取红2G标准品10.0 mg，用水溶解并定容至 10 mL容量瓶，配制成1 mg/mL的标准储备液，取1 mL储备液用甲醇定容至10 mL容量瓶，为100 μg/mL标准工作液，吸取标准工作液至10 mL容量瓶稀释至标准系列浓度。

1.3.2 样品前处理方法

样品磨碎，取适量经过沉淀蛋白、提取色素、脱脂、洗脱色素，收集调节pH，过膜上机[17-18]。具体实验条件及过程较为复杂，在做不确定度评定时，统一归纳入样品回收率不确定度评定。

1.3.3 样品加标回收率实验前处理方法

取0.1 mg红2G标准加入样品，做6组平行样品，与样品同时进行前处理，过膜及上机，取其中一个加标试样重复上机测定6次。

1.3.4 仪器检测条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：530 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 不确定度数学模型建立

高效液相色谱法测定熟肉制品中红2G的计算公式为：

式中：X-样品中红2G含量，单位为mg/kg；C-由标准曲线计算得出样液中红2G的浓度，单位为μg/mL；V-溶液定容体积，单位为mL；M-样品质量，单位为g。

2.2 不确定度来源

从计算公式和实验过程来看，熟肉制品中红2G含量测定的不确定度主要来源分为3部分，即标准品、被测样品、重复性。具体见图1。

图1 红2G含量测定的不确定度的来源

2.3 标准物质红2G引入的不确定度u1

2.3.1 标准物质配制引入的不确定度u1.1

（1）标准物质纯度引入的相对标准不确定度up。红2G的标品纯度为98%，其扩展不确定度为0.5%[19]，均匀分布，其相对标准不确定为：

（2）标准物质称量引入的不确定度um。标准品的称量为10 mg，根据标准《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008）规定，天平校准不确定度为主要分量，其不确定度为0.05 mg，矩形分布，，则由标准物质红2G的称量引入的相对标准不确定度为：

（3）标准物质储备液配制引入的不确定度uc。准确称取10.0 mg标准品于10 mL容量瓶中，用水定容，此为1 mg/mL的标准储备液。根据相关标准规定，10 mL容量瓶（A级）容量范围为（10±0.02）mL，，则由容量瓶引入相对标准不确定度为：

另一方面是由于温度波动引起的体积变化，标准《体积管检定规程》（JJG 209—2010）中规定温度波动范围为（20±2）℃，取均匀分布，，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，相对标准不确定度：

10 mL容量瓶体积的合成标准不确定度uc为u1.1（V）和u1.1（t）的合成，则合成标准不确定度uc为：

因此，由标准物质配制引入的总相对不确定度为：

2.3.2 标准物质中间液配制引入的不确定度u1.2

用1 000 μL移液器移取1 mL标准储备液（1.0 mg/mL）至10 mL容量瓶中，甲醇定容得100 μg/mL的标准中间液。其不确定度来自1 000 μL移液器和10 mL容量瓶。

（1）标准《体积管检定规程》（JJG 209—2010）中规定温度波动范围为（20±2）℃，取均匀分布，，甲醇的体积膨胀系数为1.2×10-3/℃，故温度波动引起的体积相对标准不确定度为：

10 mL容量瓶引入的相对不确定度为：

（2）量程为1 000 μL移液器移取溶液，知其最大允许误差为6 μL，，其相对标准不确定度为：

（3）温度对于1 000 μL移液器体积的影响引入的不确定度为：

（4）由标准中间液配制引入的不确定度u1.2为：

2.3.3 标准曲线配制引入的不确定度u1.3

由于配制标准系列时移取不同体积的标准液，用到不同规格的移液器，u1.3为移液器引起的不确定度u1.3（E）、容量瓶引入的相对不确定度u1.3（R）和环境温度变化引起的不确定度u1.3（t）的总和。

（1）标准工作溶液在配制过程中使用移液枪引入的相对标准不确定度见表2。按照矩形分布计算[20-21]，公式为：

表2 标准工作溶液配制过程中移液枪的不确定度

因此标准工作溶液配制过程中移液枪的使用引入的相对标准不确定度为：

（2）容量瓶的相对标准不确定度见表3。按照三角分布计算：

表3 标准工作溶液配制过程中容量瓶引入的不确定度

（3）标准溶液配制过程中温度偏差引起的溶剂体积改变引入的相对不确定度u1.3（t）。甲醇的体积膨胀系数为1.2×10-3/℃，其相对标准不确定度公式为，ΔT=2 ℃，环境温度变化引入的相对不确定度见表4。标准溶液配制过程中温度偏差引起的溶剂体积改变引入的相对不确定度u1.3（t）为：

表4 环境温度变化引入的不确定度

（4）标准溶液配制过程中的合成相对标准不确定度u1.3计算为：

2.3.4 标准曲线拟合引入的不确定度u1.4

对标准工作溶液的6个点分别测定1次，得到相应的色谱峰面积（表5），采用最小二乘法进行拟合，其公式为：

表5 标准溶液浓度与峰面积对应表

式（2）中：p为样品测定次数6，C0为样品加标的平均浓度，为所有标准溶液的质量浓度平均值。S为标准曲线的标准偏差，其中a为校准曲线斜率，b为校准曲线截距，n为标准曲线浓度点测定总次数6，xi为不同标准曲线浓度，yi为不同浓度对应的峰面积。

由上述公式计算可得样品测定中标准曲线拟合引入的不确定度，如表6所示。

表6 样品测定结果和相对标准不确定度

2.3.5 标准物质引入的不确定度u1

由标准物质引入的不确定度u1为：

2.4 样品前处理时产生的不确定度u2

2.4.1 样品称量引起的相对标准不确定度u2.1

用天平称量10.0 g样品，天平校准不确定度为主要分量，不确定度为0.5 mg，，样品的称量引入的相对标准不确定度为：

2.4.2 样品加标回收率引入的相对标准不确定度u2.2

由于样品前处理方法较为复杂，通过样品加标回收率评定对整个过程的不确定度，结果见表7。

表7 加标回收实验结果

回收率引入的标准不确定度为：

根据《测量不确定度表示指南》中要求，要校正明显的系统误差，故用t检验确定平均回收率是否有显著性差异。

在95%置信概率下，t0.95（5）=2.447，t>t0.95（5），需要做回收率矫正。

2.4.3 样品前处理过程引入的合成相对标准不确定度u2

样品前处理过程引入的合成相对标准不确定度为：

2.5 测定时的重复进样而引起的不确定度u3

将加标样品进行6次（n=6）平行测定，平均值C0为 9.71 mg/kg，标准差为：，因此 重复测量引入的相对标准不确定度为：

2.6 标准不确定度的合成和扩展

高效液相色谱法测定熟肉制品中红2G的合成相对不确定度的计算urel：取置信水平95%，包含因子k=2，则其扩展不确定度U=urel×k×C0，因此，熟肉制品中红2G的扩展不确定度合成标准不确定度：U=urel×k×C0=0.056 5×2×9.71=1.097 mg/kg，结果表述为红2G含量X=（9.71±1.097）mg/kg。

3 结论

本研究通过对高效液相色谱法测定熟肉制品中违禁添加物红2G的不确定度各分量进行评定，由此建立一套合理、科学、完整的实验分析方案，并且在结果表示中除去含量值，还应包含不确定度[22-24]。从整个分析过程可以看出，最终检测结果影响最大的分量主要来源于实验过程中标准溶液的配制及拟合，其他分量引入的不确定度都相对较小。为保证检测结果的准确性，在实际的检测过程中，应当定期维护、保养和检定仪器，使仪器保持最佳状态，并保持稳定；配制标准时，首先选用纯度较高的标准品，配制时使用精密度高的设备进行称量及定容，提高曲线配制的准确度，通过线性范围、重复次数等途径降低误差[25]，同时在实验过程中采用多种质量控制手段，以保证检测结果的科学性和准确性，降低高效液相色谱法测定红2G结果的不确定度。