曹付威 刘福林 任莹莹 陈文笙 蒋美玲 马敬傲 范凯丽 郭越生 李欣然 高艳霞

山东第一医科大学（山东省医学科学院）生命科学学院，山东泰安 271016

益母草（Leonurus japonicasHoutt.）类属于唇形科益母草属，我国大部分地区都有分布，人们常将其地上部分直接生用或经干燥后熬膏用。据《神农本草经》和《本草纲目》记载以及药理学研究，发现益母草能够有效的保护心肌和神经、抑制血小板的凝集，并具备抗炎、抗菌、抗氧化等作用［1～4］。研究表明益母草主要活性成分为二萜类、黄酮类、生物碱类等物质［5～9］。

自然界中存在很多二萜类物质，有些已是临床常用的药物，如雷公藤内酯、穿心莲内酯、银杏内酯等。研究证实二萜类化合物具有神经保护和抗炎等作用［10～13］。近年来随着对二萜类化合物抗菌作用的进一步研究，相继发现瘿花香茶菜素、内折香茶菜乙素、萜类物质YK-1和YK-2以及溪黄草提取物等二萜对细菌和真菌都具有较强的抑制作用［14～17］。

在人和家畜的生活环境中存在着一些致病菌，包括金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌，以前主要使用抗生素来抑制各类家畜致病菌。而随着限抗令的推广，急需找到抗生素的替代品。中药二萜类化合物因其优良的抑菌效果，不良反应少且不易产生耐药性等优点，可与抗生素联合使用或替代抗生素。据文献报道，益母草萜类化合物中含量最高的是二萜且主要为半日花烷型［18］，因此我们选择穿心莲内酯（半日花烷型二萜内酯）为对照，采用比色法检测益母草二萜含量。本研究采用加热回流法提取益母草二萜并利用正交试验优化其提取工艺，过硅胶柱进一步分离纯化后，考察益母草二萜的抑菌活性，为进一步开发利用益母草提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药材与菌种

益母草药材购自华佗国药大药房，产地为山东省临沂市。大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 10384保存于山东第一医科大学生命科学学院菌种保藏室。

1.1.2 试剂

穿心莲内酯标准品购于成都普思生物科技有限公司（批号PS011603，纯度＞99%）。琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏、青霉素钠购于上海生工。试剂均为分析纯，硅胶粉（200～300目）购于济南凯莱生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 益母草二萜提取过程

精确称量5.00 g益母草干粉（过60目筛），置于500 mL圆底烧瓶中，按照一定的料液比用一定浓度的乙醇溶液充分溶涨药材后，于电加热套内沸腾加热回流提取，收集滤液并浓缩得到浸膏，于60℃干燥成粉末。取适量粉末，加无水甲醇定容后，进行总二萜含量的测定。

1.2.2 二萜含量测定

1.2.2.1 绘制标准曲线 标准品穿心莲内酯的测定采用紫外分光光度计法，具体参照文献［19］。设定穿心莲内酯含量为横坐标x、吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，得出线性回归方程为y=23.114x－

0.0181 ，R2=0.996。

1.2.2.2 二萜含量测定 取适量待测样品溶液，用无水甲醇作为空白对照，在550 nm波长下测定其吸光值，通过线性方程计算提取液中总二萜含量。

1.2.3 益母草二萜提取单因素试验及正交设计

单因素试验：通过选择分析料液比、乙醇浓度、提取时间、提取次数四个因素，分析对益母草总二萜含量的影响。

正交设计试验：在单因素试验基础上，对乙醇浓度、料液比和提取时间3个主要影响因素，采用L9（33）正交试验进行工艺优化，因素水平如表1所示。

表1 因素与水平

1.2.4 益母草二萜的初步分离

用最佳提取工艺提取益母草干粉，获得大量浸膏。将浸膏溶于2倍量纯水后，先用石油醚萃取除杂后，然后用乙酸乙酯萃取3次，收集萃取溶液，经过滤、旋蒸浓缩得浸膏。浸膏溶于少量甲醇中，和200～300目硅胶400 g搅拌混匀，干法上样，于硅胶柱（12 cm×150 cm，200～300目，3 000 g）中层析，以石油醚∶丙酮9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7（V/V）进行梯度洗脱，利用薄层层析板经10%香草醛乙醇浓硫酸溶液显色检测后，合并相似洗脱组分。

1.2.5 抑菌效果研究

本试验利用大肠杆菌和金黄色葡糖球菌，采用琼脂扩散法［20］（disk agar diffusion，DAD）做体外抑菌效果研究。取0.5 g益母草二萜类化合物粗提物浸膏，用10 mL甲醇∶二氯甲烷（1∶1）配置成浓度为0.05 g/mL的抑菌溶液，用无菌蒸馏水和0.000 05 g/mL的青霉素溶液分别作为阴性对照和阳性对照。制作大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养皿，用滤纸片分别浸润各试验溶液，室温挥干后，置于培养皿中，于37℃培养箱中倒置培养24 h后，测量各抑菌圈大小，比较其抑菌效果。以上操作皆重复3次，抑菌圈大小取其平均值。

1.3 统计学分析

利用正交设计助手II V3.1设计益母草二萜含量的L9（33）试验，并利用Excel作图。采用SPSS 18.0软件进行方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 乙醇浓度的影响

选择提取次数3次、料液比1 g∶30 mL、提取时间1.5 h的条件下，分析不同乙醇浓度对益母草二萜化合物含量的影响，如图1A所示。

由图中可以看出，随着乙醇浓度的增加，含量逐渐升高，乙醇浓度为90%时达到最大值。说明90%乙醇溶液的极性与益母草二萜的相似性高，且溶剂有一定含水量，能充分溶涨益母草粉末，具有较好的提取效果。

2.1.2 料液比的影响

在乙醇浓度90%、提取次数为3次、提取时间1.5 h条件下，考察不同料液比对益母草二萜化合物含量的影响，如图1B。

由图中可以看出，随着料液比浓度的提高，二萜化合物含量逐渐提高，当料液比高于1 g∶30 mL后变化趋势变缓，考虑试剂成本及提取效果，选择1 g∶30 mL为最佳料液比。

2.1.3 提取时间的影响

在乙醇浓度90%、料液比1 g∶30 mL、提取次数为3次的条件下，考察不同提取时间对益母草二萜化合物含量的影响，如图1C。

由图中可以看出，随着提取时间的增加，含量逐渐增加，1.5 h后变化趋势明显减缓。说明随着加热时间的延长，二萜的溶出率逐渐增加，到1.5 h时后其含量变化不大，故选择1.5 h为其最佳提取时间。

2.1.4 提取次数的影响

在乙醇浓度90%、料液比1 g∶30 mL、提取时间1.5 h的条件下，考察不同提取次数对益母草二萜含量的影响，如图1D。

图1 各因素对益母草总二萜含量的影响

从图中可以看出，提取次数增加，二萜含量增加，当提取3次之后，二萜化合物含量基本保持不变。这说明提取3次已经基本将二萜提取完全，综合考虑试剂成本问题，将二萜的最佳提取次数固定为3次。

2.2 正交试验法优化益母草二萜提取工艺

2.2.1 正交试验法结果

在单因素试验的基础上，料液比、乙醇浓度和提取时间对益母草二萜化合物提取影响较大，故对三因素进行正交试验。L9（33）益母草二萜化合物含量的正交试验结果，以及利用统计软件SPSS 18.0对其进行直观分析和方差分析，结果分别见表2和表3。

表3 方差分析表

从表2，3可以看出，益母草二萜含量的影响因素排序为：乙醇浓度＞提取时间＞料液比。从方差分析结果可知，乙醇浓度对二萜含量的影响有统计学意义，而料液比和提取时间则无统计学意义。从表2中结果可知，益母草二萜的最佳提取工艺为：90%乙醇、1 g∶30 mL料液比、2 h提取时间，此时其含量最高。

表2 正交试验设计与结果

2.2.2 验证试验

验证益母草二萜的最佳提取工艺，测定其含量，其结果见表4。

表4 验证试验结果

2.3 硅胶柱层析初步分离二萜类化合物

利用优化的提取工艺制备益母草二萜，经浓缩后得大量浸膏。取适量浸膏用两倍体积水进行彻底分散溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取3次。因二萜类化合物极性较大，绝大部分溶于乙酸乙酯溶液，故收集乙酸乙酯萃取液，过滤旋蒸浓缩得浸膏状物质。将浸膏溶于少量甲醇中，和适量200～300目硅胶搅拌均匀后干法上样200～300目硅胶柱，用9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，6∶4，3∶7（V/V）进行梯度洗脱，结合200～300目硅胶板，用10%香草醛乙醇溶液进行显色反应，结果发现益母草二萜经显色后呈紫色斑点，且比例为7∶3的石油醚∶丙酮展开剂的斑点清晰，数目较多且拖尾现象不明显，Rf在0.3到0.7之间。因此我们选取石油醚∶丙酮（7∶3）作为益母草乙酸乙酯部位浸膏的洗脱溶剂进行洗脱，收集含量最大的组分，经浓缩后得到益母草二萜粗提物浸膏。

2.4 益母草二萜类化合物抑菌结果分析

采用琼脂扩散法，分析益母草二萜类化合物粗提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的影响，无菌蒸馏水和青霉素溶液分别作为阴性对照和阳性对照，结果如图2所示。

图2 益母草二萜类化合物抑菌效果

测量三组重复试验中各试验溶液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈大小，结果如表5。

抑菌效果按照抑菌圈直径大小进行评判：0～6 mm无抑菌效果；大于6 mm具有抑菌效果，其中，6～10 mm低度敏感，10～15 mm中度敏感，15 mm以上高度敏感。由表5中可以看出，益母草二萜类化合物能够显著抑制金黄色葡萄球菌，且其抑菌效果与青霉素相接近，而益母草二萜类化合物对大肠杆菌几乎没有抑菌效果。

表5 益母草二萜抑菌效果/直径（mm）

3 讨论

二萜类化合物作为益母草的主要成分之一，因其具有很多重要的药理活性，故有很高的应用价值和广阔的前景［1］。因目前对于益母草二萜类化合物的抑菌研究较少，故本课题主要研究其提取分离条件和抑菌活性。本试验以同为半日花烷型的穿心莲内酯作为评价提取效果的指标，优化益母草二萜的提取工艺，因提取工艺的优劣与否，直接关系到药材的利用度和成药效果，故对中药材的提取工艺优化的研究显得尤为重要。

利用加热沸腾回流的方式提取益母草二萜，具有提取设备简单、投入少、提取效果高等优点，且加热的方式使二萜的溶出速度快，大大节省了生产时间。在提取过程中，常会考虑提取溶剂的浓度、料液比、提取的时间和提取的次数对提取效果的影响，故常用正交试验法对这些因素进行大量试验，以得到最佳提取工艺。

实验结果表明，在提取条件为90%乙醇浓度、1 g∶30 mL料液比、2 h提取时间时，益母草二萜的平均含量为3.38%。提取后对益母草二萜进行初步除杂，因二萜极性较大，所以将益母草二萜乙醇提取物用适量甲醇溶液溶解后，先用石油醚除杂，再用乙酸乙酯进行萃取，然后选用层析效果比较好的硅胶柱层析后，得到益母草二萜粗提物浸膏。实验表明该混合物具有很好的抑菌效果，能够显著抑制金黄色葡萄球菌，为进一步开发益母草二萜为抑菌药物提供了一定参考。下一步课题组将会继续分离分析其单体化合物，为更深层次地挖掘益母草的临床应用奠定基础。

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