杜 炜，栾兆进，宋慧子，王兆琛，赵勇超，张家新

（内蒙古农业大学动物科学学院 010018）

1 实验方法

1.1 附睾上皮细胞的分离培养

将附睾头、体、尾组织分离，分别浸泡在加入PS的DPBS中使附睾组织中的精子成分上游，用眼科手术剪刀将组织剪成2～3mm小块，并剔除其中结缔组织，移入1mg/ml胶原蛋白酶Ⅳ中，37℃水浴震荡消化30min，用孔径为0.15mm不锈钢滤网将消化液过滤，用DPBS冲洗滤网上的管状组织块，RPMI-1640培养基1350r/min离心5min清洗3次取得管状组织块，每个60皿中约放置60个块，加入3mLRPMI1640培养基（含体积分数10%胎牛血清、5µg/mL转铁蛋白、100nmol/L雄激素、50U/mL青霉素和50µg/mL链霉素）37℃、5%CO2培养箱中培养，待单层细胞融合度达80%时，去掉组织块，即得原代附睾上皮细胞[1]。

1.2 附睾上皮细胞体外传代培养

待细胞融合接近80%～90%时传代，加入0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化2min，光镜下观察到细胞收缩变圆或少数脱落浮起时，加入完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮后，收集离心，重悬后接种到新的培养瓶[2]。

1.3 实时荧光定量PCR测定附睾头、体、尾上皮细胞相关基因

使用TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（Takara）对GPx5基因进行相对定量试验。反应条件如下:95℃、10min;95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，进行40个循环反应。反应体系为20μL:TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（2×）10μL，cDNA2μL，上 下 游引 物 各0.8μL，ddH2O6.4μL。利用2-ΔΔct法 与β-actin进行相对定量计算[3]。

表1 P66、SERPIN1、DCXR 、AK1和Clu基因引物序列

2 实验结果

2.1 附睾头、体、尾上皮细胞的分离及传代培养

附睾上皮细胞，24h内以球状团块形式贴壁生长。36h后，细胞团逐渐变平并扩散成单层，外观呈菌落状的生长形态。原代附睾头上皮细胞、附睾体上皮细胞3d内达到融合。可以用0.25%胰蛋白酶消化传代至少8～10次（传代比率为1∶2）。……