雷 静，廉苇佳，陈 雅，韩 琛，任红松，肖 丽

(1.新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所，新疆吐鲁番 838000；2.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】葡萄干是葡萄的主要加工品之一，含糖量高，富含多种人体所需氨基酸、维生素和矿物质[1,2]。葡萄干含水量低，方便运输和贮藏[3,4]。无核绿葡萄干是新疆特色干果制品，占全疆葡萄干的70%以上，传统干制绿色葡萄干主要是采用蜂眼式透风晾房阴干方法[5,6]。绿葡萄干清洗会有褐变现象。分析无核白绿葡萄干清洗前后酚类物质变化及其与酶促褐变的关系，研究葡萄干清洗酶促褐变的原因，为绿葡萄干清洗技术提供理论依据[7,8]。【前人研究进展】白俊文[9]认为葡萄干燥加工中存在干燥时间长和褐变问题，将高温高湿气体射流冲击烫漂技术(HHAIB)用于葡萄干燥前处理，研究了烫漂处理对葡萄PPO酶活性、葡萄干燥动力学以及色泽的影响；张利娟等[10]评价绿葡萄干干制过程中褐变的发生对其抗氧化活性的影响，分析了抑制无核白绿葡萄干褐变的方法。李晓丽等[11]研究了无核白葡萄干制过程中酚类物质的变化与葡萄干发生褐变的关系。最主要的酶促褐变底物为儿茶素[11]；Williamson and Carughi等[15]研究表明，葡萄干中最丰富的酚类化合物是槲皮素、山奈酚、酚酸以及咖啡酸和香豆酸。Breksa III A P等[16-20]。【本研究切入点】虽然研究葡萄干的文献很多，但是专注研究葡萄干清洗褐变的研究报道较少。研究无核白绿葡萄干清洗前后酚类物质含量变化及与酶促褐变的关系。【拟解决的关键问题】分析无核白绿葡萄干清洗前后酚类物质含量变化及其与酶促褐变的关系，研究清洗无核白绿葡萄干发生酶促褐变的机理，为葡萄干精深加工提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄干

绿葡萄干于2018年12月购买自新疆吐鲁番市东疆市场，品种为无核白(V.viniferacv. Thompson Seedless)。

1.1.2 试剂

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、甲醇、福林-肖卡试剂均为分析纯；绿原酸、没食子酸、阿魏酸、原儿茶酸、山奈酚、香草酸、咖啡酸、丁香酸、P-香豆酸、芥子酸、龙胆酸、儿茶素、槲皮素标准品购自Anpel公司。

1.1.3 仪器与设备

FA2004N电子天平，上海菁海仪器有限公司；UV754N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；KQ-500E机械式超声波清洗器，东莞康士洁超声波科技有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；全能台式高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-离子淌度飞行时间质谱，美国Waters公司；Scotsman AF 100 AS雪花制冷机，上海旦鼎国际贸易有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄干清洗

挑选无病虫害，无损伤，大小均匀，色泽均一的葡萄干为材料。无核白绿葡萄干用常温自来水清洗2遍，每次清洗时间1 min，于通风处自然晾干。

1.2.2 葡萄干褐变度的测定[12，13]

取3 g(干物质)葡萄干按1∶10加蒸馏水，匀浆后，在4℃条件下9 000 r/min离心30 min，取上清液在420 nm处测OD值。

1.2.3 酚类物质组成测定

参照Kolniak-Ostek J等[14]方法。采用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-离子淌度飞行时间质谱进行酚类物质单体测定。色谱条件如下：色谱柱采用UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流动相由溶剂A(0.1%甲酸)和溶剂B(100%乙腈)组成。梯度洗脱：0～1 min，99%溶剂A；1～12 min，99%～0溶剂A；12～13.5 min，0～99%溶剂A；保持不变以重新平衡该柱子。流速0.45 mL/min，进样量10 μL，柱温45℃，进样室温10℃。质谱条件：毛细管电压2 500V，锥形电压30V，源温度100℃，去溶剂化温度300℃，脱溶剂气体(氮气)流量300 L/h，电压斜坡循环从0.3到2V。

1.2.4 酚类物质标准曲线建立

利用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-离子淌度飞行时间质谱体系鉴定清洗前后无核白绿葡萄干中的主要酚类物质，确定各自的线性回归方程，判断该体系的分离度和方程的线性关系。

1.2.5 无核白绿葡萄干酶促褐变底物鉴定[15]

多酚氧化酶提取：准确称取一定量葡萄干，加入18 mL 0.2 mol/L pH 5.8预冷的磷酸缓冲液，用均质机匀浆，在4℃条件下浸提2.9 h，在同样4℃下9 000 r/min离心15 min，取其清液。重复1次，得到葡萄干多酚氧化酶提取液。

多酚氧化酶活性测定：在试管中加入3 mL 0.2 mol/L pH 6.8磷酸缓冲液，1 mL不同反应物(没食子酸、龙胆酸、儿茶素、阿魏酸、香草酸、P-香豆酸、原儿茶酸、山奈酚、绿原酸、芥子酸、丁香酸、咖啡酸、槲皮素)，1 mL粗酶液，混合均匀，在420 nm吸收波长下测定其在4 min内的吸光度值，每隔30s测1次，根据公式(1)计算酶活。鉴定无核白绿葡萄干清洗酶促褐变的底物。

(1)

式中：△A为反应时间内吸光度值的变化；

Vr为提取酶液总体积(mL)；

W为取样质量(g)；

Vs为测定时取用酶液体积(mL)；

t为反应时间(min)。

1.2.6 无核白绿葡萄干清洗前后褐变度与酚类物质含量变化之间的相关性

分别测定无核白绿葡萄干清洗前后的褐变度，使用SPSS软件相关性分析法分析清洗前后无核白绿葡萄干褐变度与酚类物质含量变化的相关性。

1.3 数据处理

数据采用采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析和相关性分析，当P<0.01时，差异极显著，当P<0.05时，差异显著。

2 结果与分析

2. 1 酚类物质标准曲线

研究表明，无核白葡萄中酚类物质有14种，参与酶促褐变的底物有6种，分别为顺式-白藜芦醇、原花青素B2、阿魏酸、儿茶素、反式-咖啡酸、对羟基肉桂酸，葡萄干中也含有儿茶素、表儿茶素、没食子酸、丁香酸、香草酸、绿原酸、原儿茶酸和阿魏酸等酚类物质。单体酚标准品确定各自的线性回归方程，相关系数均达到0.999以上，线性关系好，检测体系分离度好。鉴定出无核白绿葡萄干清洗前后有山奈酚、阿魏酸、原儿茶酸、香草酸、P-香豆酸、龙胆酸、儿茶素、绿原酸、芥子酸、丁香酸、没食子酸、咖啡酸和槲皮素共计13种主要的酚类物质。表1

表1 无核白绿葡萄干中 13种酚类物质标准品的线性回归方程Table 1 Linear regression Equations of 12 phenolics standards in green raisins

2.2 无核白绿葡萄干清洗前后酚类物质含量的变化

研究表明，无核白绿葡萄干在清洗前儿茶素含量最高，为0.105 mg/100g，龙胆酸含量最低，为0.001 mg/100g。绿葡萄干在清洗后儿茶素含量仍然最高，为0.052 mg/100g，绿原酸含量最低，为0.000 65 mg/100g。儿茶素在清洗前的含量就非常高，是其它单体酚类物质含量的几十到100倍，在葡萄干清洗过程中损失一部分，但是其含量还是很高。绿葡萄干通过清洗干燥后没食子酸、原儿茶酸的含量增加，增加的含量非常小，分别增加了9.83%和0.89%，其他酚类物质含量都是减少的，其中儿茶素和槲皮素含量减少的较多，分别减少了50.48%和57.25%。酚类物质减少大小依次为：P-香豆酸>槲皮素>绿原酸>儿茶素>山奈酚>丁香酸>阿魏酸>香草酸>咖啡酸>龙胆酸>芥子酸。绿原酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸和丁香酸的质量变化没有显著性差异，原儿茶酸、芥子酸和龙胆酸的质量变化没有显著性差异，儿茶素、槲皮素、山奈酚、P-香豆酸、没食子酸的质量变化有显著性差异。表2

表2 无核白绿葡萄干清洗前后单体酚类物质组成和含量变化Table 2 Changes in composition and content of monophenols in green raisins before and after cleaning

2.3 无核白绿葡萄干酶促褐变底物鉴定

研究表明，无核白绿葡萄干多酚氧化酶催化咖啡酸酶促褐变酶活是35.07 U/mL，催化绿原酸的酶活是3.48 U/mL。无核白绿葡萄干多酚氧化酶对主要酚类物质的催化褐变活性大小依次为咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>儿茶素>山奈酚>绿原酸，而葡萄干多酚氧化酶对阿魏酸，原儿茶酸、香草酸、龙胆酸、芥子酸、丁香酸、没食子酸无反应活性。对比清洗前后，葡萄干中咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、儿茶素、山奈酚和绿原酸这几种酚类物质含量也是减少的，P-香豆酸和槲皮素含量减少的最多，与多酚氧化酶反应酶活性值也较高，分别排在第2和第3，咖啡酸与多酚氧化酶反应酶活性值最高，但清洗后含量降低率仅为10.21%，咖啡酸与葡萄干多酚氧化酶的结合能力大于P-香豆酸和槲皮素与葡萄干多酚氧化酶的结合能力。不同酚类物质与葡萄干多酚氧化酶结合能力大小依次为咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>儿茶素>山奈酚>绿原酸，而阿魏酸、原儿茶酸、香草酸、龙胆酸、芥子酸、丁香酸和没食子酸与葡萄干多酚氧化酶不结合或基本不结合，葡萄干多酚氧化酶可以与多种酚类物质反应，而不是具有特异性底物。无核白绿葡萄干清洗前后酚类物质减少是被多酚氧化酶催化氧化成醌类物质所致，醌类物质自聚或与其他物质聚合而生成褐色或褐色物质，导致清洗后葡萄干褐变。无核白绿葡萄干清洗酶促褐变的底物主要是槲皮素、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和儿茶素。阿魏酸、香草酸、龙胆酸、芥子酸和丁香酸不与或者基本不与葡萄干多酚氧化酶结合，可能会与苯丙氨酸解氨酶或过氧化物酶等酶结合反应。原儿茶酸和没食子酸清洗后含量增加但不与多酚氧化酶反应，可能清洗过程中由于水分进入葡萄干内部，内部成分之间发生化学反应，导致2种物质含量都有增加，原儿茶酸含量仅增加了0.89%，没食子酸增加较多，增加了9.83%。表3

表3 无核白绿葡萄干多酚氧化酶对不同底物催化酶活性Table 3 Catalytic browning activity of green raisin polyphenol oxidase on different substrates

2.4 无核白绿葡萄干清洗前后褐变度与酚类物质含量变化之间的相关性

研究表明，无核白绿葡萄干清洗前后褐变度与清洗中酶促褐变的底物山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、儿茶素和槲皮素呈显著负相关(P<0.05)，相关性大小由高到低是咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>儿茶素>山奈酚>绿原酸，山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、儿茶素和槲皮素对无核白绿葡萄干清洗后褐变的影响显著。绿原酸与无核白绿葡萄干褐变度的相关性最小为-0.866，且相对于其它5种酚类物质对褐变度的影响不显著。表4

表4 无核白绿葡萄干清洗前后褐变度与酚类物质含量变化之间的相关性Table 4 Correlation between browning degree and phenol content before and after cleaning seedless green raisins

3 讨 论

褐变通常分为酶促褐变和非酶褐变两类。酶促褐变是指在氧气存在的条件下，多酚氧化酶催化酚类物质向醌及其聚合物转变的过程，反应生成褐色素或黑色素造成褐变现象的发生。非酶褐变则是指没有酶参与时发生的褐变，主要包括美

拉德反应和焦糖化反应[21]。有研究表明，有些水果的褐变不仅与多酚氧化酶(PPO)活性有关，还与酚类物质的浓度有关，也有些水果的褐变仅仅与PPO活性相关。李晓丽等[11]研究得出无核白葡萄主要酚类物质单体中有6种酚类单体与多酚氧化酶发生反应，即原花青素B2、对羟基肉桂酸、儿茶素、反式-咖啡酸、顺式-白藜芦醇、阿魏酸。在干制过程中褐变度与总酚、原花青素B2、对羟基肉桂酸、儿茶素、反式-咖啡酸、顺式-白藜芦醇呈显著相关性。Hogan等[22]认为葡萄的褐变度与总酚、原花青素、儿茶素和根皮苷相关性较高。

前人大多从葡萄干制过程中发生酶促褐变的角度开展试验研究。但是围绕无核白绿葡萄干清洗褐变的研究非常少，研究主要针对无核白绿葡萄干清洗干燥后发生的酶促褐变开展研究，通过试验分析发现，参与葡萄干清洗酶促褐变的酚类物质与葡萄干制过程中的酚类物质不同。酚类物质与多酚氧化酶反应的活性也不同。无核白绿葡萄干清洗前后主要酚类物质单体中有6种酚类单体与多酚氧化酶发生反应，主要为槲皮素、儿茶素、咖啡酸、山奈酚、P-香豆酸、绿原酸。

葡萄干清洗干燥后发生的褐变主要是酶促褐变，但是非酶促褐变也伴随其中，这主要是因为葡萄干中的糖分为68 g/100g左右，在清洗之后，需要用热泵干燥机快速干燥，干燥温度为45℃左右。葡萄干在这样的温度之下会发生一定程度的焦糖化反应[23]。这样就会影响无核白绿葡萄干的颜色，发生轻微的非酶促褐变。

4 结 论

4.1无核白绿葡萄干清洗前后P-香豆酸、槲皮素、儿茶素等11种酚类物质含量减少。

4.2无核白绿葡萄干多酚氧化酶对主要酚类物质的催化褐变活性大小依次为咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>儿茶素>山奈酚>绿原酸，而葡萄干多酚氧化酶对阿魏酸、原儿茶酸、香草酸、龙胆酸、芥子酸、丁香酸和没食子酸无反应活性。说明无核白绿葡萄干清洗酶促褐变的底物主要是槲皮素、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和儿茶素。

4.3咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、儿茶素和山奈酚这5种酚类底物含量变化与葡萄干清洗前后褐变度有显著的相关性，这5种酚类物质对无核白绿葡萄干清洗褐变度的影响显著，而绿原酸对清洗褐变度的影响不显著。

4.4酚类物质咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、儿茶素、山奈酚和绿原酸含量低的绿葡萄干在清洗过程中褐变程度较小，将此6种酚类物质含量作为葡萄制干品种选择和葡萄育种的一项指标。