胡如荣

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，广泛分布于自然界及各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的耐受性，可引起多种疾病，国内外都有被此污染的报道。因此，我国食品安全国家标准GB 8537《饮用天然矿泉水》2008版中就增加了对铜绿假单胞菌的要求，并于2018版中提高了对铜绿假单胞菌指标的要求，2021年版《国家食品安全监督抽检实施细则》也将铜绿假单胞菌指标作为包装饮用水的重点监测项目之一。2021年1-9月全国各省市场监督管理局对包装饮用水进行抽检，其中，微生物项目抽检不合格的产品结果显示，约95%为铜绿假单胞菌不合格。因此，准确而快速地检测矿泉水中铜绿假单胞菌污染情况，对于保障人民饮水安全和评价工厂检测能力显得尤为重要。

能力验证即通过实验室间的比对，按照预先设定的标准规则来评价参加者的能力。实验室可以利用能力验证的方法对检测人员能力、方法验证、数据或结果的准确性和不确定度进行评价，对于满足监管机构和提升公司产品出厂检验准确性具有重要意义。本实验室分别通过参加中国检验检疫科学研究试验测试评价中心ACAS-PT1117和大连中食国实检测技术有限公司组织的铜绿假单胞菌能力验证和（定量）测量审核，来验证检测中心出具的检测报告是否具有良好的可靠性，并以此作为公司铜绿假单胞菌检测质量提升的理论支持。

一、材料和设备

1.原材料及主要试剂。标准样，21-M797、21-Q246，中国检验检疫研究院测试评价中心;铜绿假单胞菌（定量测试）样品-064，大连中食国实检测技术有限公司;假单胞菌CN选择性培养基，广东环凯微生物科技有限公司;营养琼脂，广东环凯微生物科技有限公司;氧化酶试纸、乙酰胺肉汤、钠氏试剂、绿浓菌素测定培养基，广东环凯微生物科技有限公司;配置用水，检测中心自制超纯水。

2.主要实验设备。超净工作台，SW-CJ-ID，苏州博莱尔净化设备有限公司;生化培养箱，SHP-150，广东环凯微生物科技有限公司;显微镜，DYS系列，上海点应光学仪器有限公司;暗箱式紫外分析仪，ZF-20D，上海宝山顾村电光仪器厂;高压灭菌器，BSC-250，上海申安医疗器械厂;电子天平，0.1g/500g，双节测试仪器厂;移液枪，1000-5000μL，Dragon-lab。

二、实验和方法

1.样品预处理。分别依据ACAS-PT1117（2021）矿泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证参试指导书2.3条款和矿泉水中铜绿假单胞菌（定量）测量审核参试指导书的要求，对样品进行预处理。（1）中检样品：在无菌级的超净工作台上打开西林瓶，用移液枪加入10mL无菌水，反复吹吸溶解后转移至容量为1000mL的三角瓶中，再反复用余下的无菌水清洗西林瓶内壁，回收至三角瓶中，最终三角瓶中的菌液定容为520mL，即为待测原液A。（2）大连中食国实样品：用稀释液2-4mL对西林瓶再水化，反复清洗西林瓶，并回收至无菌瓶中，稀释液合计40mL;将10mL稀释液添加到240mL的无菌生理盐水中，最终定容至250mL，即为待测液原液A。

2.样品稀释。将待测原液A参照国标GB 4789-2016《菌落总数测定》样品稀释方法进行相应的稀释。（1）中检原液：用移液枪分别吸取50mL原液A、450mL无菌水，混匀即为10倍稀释待测液B;用移液枪分别吸取50mL待测液B、450mL无菌水，混匀即为100倍稀释待测液C;用移液枪分别吸取50mL待测液C、450mL无菌水，混匀即为1000倍稀释待测液D（待测液B、C、D分别平行制备2份）。（2）大连中食国实原液：取25mL待测原液A加入到225mL稀释液中，定容至250mL，作为10倍稀释待测液B，以此类推依次作相应梯度稀释。

3.样品过滤。样品过滤需在超净工作台进行。先用无菌镊子夹取无菌滤膜的边缘部分，将糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，将250mL无菌滤杯固定好，再分别将待测原液A（ 1份）、10倍稀释待测液B（2份）、100倍稀释待测液C（2份）、1000倍稀释待测液D（2份）通过孔径0.45μm的滤膜过滤，最后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平皿上，平铺时要避免在琼脂和滤膜之间留有气泡，并做好阴性和阳性对照。培养温度：36±1℃，培养周期：24-48h。

三、结果与分析

1.结果观察与计数。中检样品21-Q246、21-M797在10倍稀释液B和100倍稀释液C平皿形成了可计算的分散的典型菌落，而待测原液A的菌落數目多不可计，1000倍稀释液D未长菌。大连中食国实样品-064待测原液A和10倍稀释液B平皿形成了可计算的分散的典型菌落，100倍稀释液C和1000倍稀释液D均未长菌。

2.可疑菌落的确证性试验。根据GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检验方法》57.5.3-57.5.4条款要求，对可疑菌落进行确证性试验，菌落选择和验证步骤详见表1。

样品21-Q246、21-M797和样品-064上的产荧光（非蓝/绿）菌落经常规生化验证实验和绿脓菌素试验，鉴定为铜绿假单胞菌。结合CN平皿上可疑菌落的计数结果，样品21-Q246报送结果为540CFU/250mL，样品21-M797报送结果为890CFU/250mL，样品-064报送结果为141CFU/250mL。

3.实验结果。样品21-Q246的检测结果为540CFU/250mL，样品21-M797的检测结果为890CFU/250mL，取得z值分别为-2.8和-2.5，结果可疑，经过对整个检测过程的复盘排查，最终确认影响因素主要有两个：一是样品预处理没有充分混匀，原液稀释时仅用移液枪来回吹吸;二是样品快递过程存活率低。对中国检验检疫科学研究试验测试评价中心的试验分析进行改进后，通过参加大连中食国实检测技术有限公司测量审核，取得Z值为-1.68，说明本实验室具备检测铜绿假单胞菌的能力。

四、结论与讨论

本实验室通过参加由中国检验检疫科学研究院和大连中食国实检测技术有限公司组织实施的矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证及定量测量审核实验，依据能力验证指导书及GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检测方法》对样品进行检测，并总结了检测过程的影响因素及一般步骤，供实验室在进行能力验证或测量审核时参考。在实验过程中发现，不同机构提供的操作指导书存在比较大的差异，尤其在样品预处理-样品稀释方面。另外，GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检测方法》中没有稀释方法，实验过程中对矿泉水样品参照GB4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》进行相应的稀释处理，使滤膜上能够形成分散的单一菌落，便于可疑菌落的观察计数，为准确报告饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况提供保障。