不同形态多酚枇杷叶提取物活性及其应用研究

2021-11-04郭松斌杨韧强柯文林

食品工业 2021年10期

郭松斌，杨韧强，柯文林

福建中烟工业有限责任公司技术中心（厦门 361012）

在中国，枇杷叶被广泛用作功能性食品及中药制剂的重要来源，枇杷叶中含有各种生物活性化合物，包括酚酸、黄酮类化合物和多糖[1]。其中，多酚具有较强的抗氧化活性，可防止活性氧（ROS）损伤、DNA突变、糖尿病、心血管疾病和心脏病[2-4]。

研究表明，枇杷叶的酚类化合物与其他类似植物一样，通常以可溶性游离、可溶性和不溶性结合的形式存在。研究报道，特定的Grindamyl果胶酶辅助提取已成功地用于提高黑加仑中多酚的回收率[5]，纤维素酶和阿魏酰酯酶可显著促进麦麸酚类化合物的释放[6]，纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、半纤维素酶和葡聚糖酶可以有效地从未成熟的苹果中释放酚类化合物[5,7-8]，但尚未见到酶在枇杷叶上的应用的报道。基于此，此次研究的主要目的是：（1）研究酶辅助提取方法得到不同形态多酚提取物；（2）比较不同酶提取枇杷叶中酚类提取物的抗氧化活性；（3）测定酶提取枇杷叶中可溶性酚类提取物对DNA损伤的保护作用；（4）评价复合酶提取枇杷叶可溶性酚类提取物对卷烟感官质量的影响。

1 试验材料与方法

1.1 原料和试剂

多酚标准品（＞99.5%）、Folin-Ciocalteu的苯酚试剂、过硫酸钾、FeCl3、Trolox、ABTS、DPPH：Sigma-Aldrich；MiniBEST质粒纯化试剂盒、pMD-18T质粒DNA（Takara Biotechnology）；纤维素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、复合酶（包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）Youtell Biochemical。

枇杷叶，市售。

1.2 仪器和设备

RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化器材厂）；OLB-110DW恒温水浴振荡器（山东博科科学仪器有限公司）；常规烟支打烟器（荷兰MASCOTTE公司）；MP1100B电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HS-4水浴锅（上海医疗器械五厂）；HY-727SPC型分光光度计（无锡市英之诚高速分析仪器有限责任公司）；恰尔TDL-5A台式离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）。

1.3 酶法处理样品过程

在锥形瓶中分别加入5 g研磨后的枇杷叶和20 mL H2O（预先用0.02 mol/L柠檬酸调节到pH 5.0），分别编号，按照表1加入对应的酶，后将锥形瓶置于50 ℃恒温振荡水浴锅中12 h后，将样品放置于80 ℃烘箱中20 min使酶失活；最后将样品在60 ℃条件下处理15 h，收集酶预处理后的干燥枇杷叶，备用。

表1 酶法处理枇杷叶样品所需酶种类及添加量

1.4 酚类组分的提取

取1 g 1.3小节中酶预处理后的枇杷叶，加入10 mL 70%的甲醇，在40 ℃条件下回流提取1 h，将混合物过滤后分别收集上清液和固体沉淀。其中，上清液中再加入70 mL乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，分别合并乙酸乙酯萃取相和水相，将萃取液至于旋蒸仪上除去乙酸乙酯，萃取物中加入5 mL 50%甲醇溶解后，在-20 ℃条件下暂存，得到游离酚类（FP）组分；在水相中加入40 mL 2 mol/L的 NaOH水解4 h，后用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0；在酸化后的水相中加入70 mL乙酸乙酯进行萃取，处理过程及样品保存方式同前所述即可得到可溶性结合酚类（SCP）物质；在固体沉淀中加入50 mL 2 mol/L的NaOH，在室温下水解4 h，后用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0。收集酸化后的上清液，用乙酸乙酯进行萃取，萃取液处理方式同前所述，即得到不溶性结合酚类（IBP）。

1.5 ABTS自由基阳离子（ABTS+）清除活性

ABTS分析方法见参考文献[9]。

1.6 DPPH自由基清除活性

DPPH测定见参考文献[10]。

1.7 还原铁抗氧化能力（FRAP）测定

FRAP的分析方法见参考文献[11]。

1.8 超螺旋DNA链断裂的抑制作用

采用Liyana-Pathirana等[12]方法，并稍加改动。将10 μL的可溶性酚类提取物（2 mg/mL）、5 μL pMD 18-T质粒DNA（200 ng/μL）以及10 μL Fenton试剂混合，混合物避光，在37 ℃条件下培养30 min。以槲皮素为阳性对照，磷酸盐缓冲液作为空白对照。用超螺旋DNA的相对百分比来评估可溶性酚类提取物对DNA的保护作用，如式（1）所示。该数值越小表示样品对超螺旋DNA的保护作用越小。

式中：Is为超螺旋DNA的比例；IN为开环DNA的比例。

1.9 统计分析

所有试验重复3次，结果以“平均值±标准差（SD）”表示。使用SPSS 13.0统计软件（StatSoft，Tulsa，OK，USA）进行单因素方差分析。

1.10 感官评价

将试验所得的多酚提取物按一定的添加量添加到卷烟料液中吸收2 h，在105 ℃的烘箱中烘干并平衡水分后进行打烟制样，由感官评价小组参考中式卷烟感官评价的方法进行打分。

2 试验结果与讨论

2.1 酶辅助提取法生物活性的变化

试验采用3种抗氧化评价模式来评价不同酶辅助提取后枇杷叶提取物中多酚类活性的变化。表2～表4分别为不同酶辅助提取枇杷叶中的FP、SCP、IBP和总多酚（TSP）对ABTS+、DPPH的清除能力及对还原铁的抗氧化能力。结果显示：与对照组相比（未添加酶），在提取过程中添加纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、复合酶可提高FP、SCP和TSP的ABTS值，复合酶效果最明显；在枇杷叶提取过程中添加木聚糖酶并不会显著增加可溶性酚类物质，相反，可溶性酚类ABTS值略有下降。

表2 不同处理方式下不同结合态多酚类化合物ABTS值

表3 不同处理方式下不同结合态多酚类化合物的DPPH值

表4 不同处理方式下不同结合态多酚类化合物的FARP值

2.2 对DNA损伤的保护作用

试验对枇杷叶多酚对DNA损伤的保护作用进行了研究。由图1和图2可知：芬林试剂直接与超螺旋质粒DNA孵育后对超螺旋DNA造成了损伤；而在孵育体系中加入纤维素酶、β-葡萄糖苷酶或复合酶酶解提取的枇杷叶多酚物质后，超螺旋DNA的比例有较大的提高，说明枇杷叶多酚可起到对DNA损伤的保护作用；但在木聚糖酶解组未观察到此现象，可能是由于在枇杷叶提取过程中添加木聚糖酶并没有提高枇杷叶多酚的含量，因此不能清除芬林试剂中的羟自由基，这验证了前面的抗氧化活性结果。

图1 不同酶辅助提取方法的可溶性酚类对Fenton试剂诱导保护作用

图2 不同提取产物可溶性酚类对Fenton剂诱导的DNA氧化的保护作用

2.3 不同形态的多酚枇杷叶提取物在卷烟中加料应用

将复合酶处理后制备的3种不同形态多酚类枇杷叶提取物按照0.04%的比例以加料的方式在卷烟中进行应用，评吸小组的评价结果如表5所示。结果显示：游离态枇杷叶提取物在卷烟中加料应用后的感官评价效果最好，能增加青香香韵，提调卷烟清甜香，改善香气质感，烟气浓度稍有提升，甜感舒适自然；可溶性结合态枇杷叶提取物青香风格虽有所保留，浓度上有所增加，但香气的清晰明亮度上会有所下降，口腔出现干燥感；而不可溶性结合态多酚的枇杷叶提取物在卷烟中应用后虽然烟气浓度增加，但特征风格较弱，烟香的质感下降，香气显浑浊，口感稍欠。

表5 不同形态多酚的枇杷叶提取物对卷烟感官品质的影响

试验进一步研究了添加不同比例的游离态枇杷叶提取物对卷烟感官评价的影响，感官评价小组的评吸结果见表6～表8及图3。

图3 0.04%添加游离态枇杷叶提取物对卷烟感官质量的影响

表6 不同添加比例的游离态多酚枇杷叶提取物香气风格感官评价结果

表7 不同添加比例的游离态多酚枇杷叶提取物口味风格感官评价结果

表8 不同添加比例的游离态多酚枇杷叶提取物舒适性特征及烟气特征感官评价结果

随着游离态多酚枇杷叶提取液添加比例的提高，卷烟的多项感官评价指标均有所改善，游离态多酚枇杷叶提取液可提调卷烟清甜香风格，增加青香香气，提升烟气浓度和厚实饱满感，增加甜感，舒适性上也有所改善。但当添加比例达到0.06%时，抽吸时显著提升的青香香韵与烟香的协调性较差，烟气的细腻柔和程度逐渐下降，同时对卷烟的舒适感造成一定的负面影响，具体表现为刺激增大、喉部的干燥感和口腔残留感等。因此，此游离态多酚枇杷叶提取物在卷烟中较合适的添加比例为0.04%。