宋燕州，张昆，陈琦军，魏文平，赵新，李志伟，李伟

0 引言

NEK7（NIMA-related kinase 7）作为NEK家族中的重要一员，在纺锤体形成及促进有丝分裂过程中发挥了重要作用：在有丝分裂期间，NEK7主要定位于中心体，通过减少G2/M期的中心体周膜物质的丢失及停搏来确保有丝分裂进程的准确执行[1-3]。

既往研究表明，相较于正常组织，NEK7在胆囊癌中高表达，并且与肿瘤分化、转移和患者生存率之间有着显著关系[4]。本课题组前期的研究表明NEK7在肝癌组织中呈高表达，且其表达水平与患者预后密切相关。

本实验拟在前期研究基础上，进一步从细胞学角度探究NEK7表达与细胞生物学行为之间的关系，并初步探究引起相关变化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

肝癌细胞系HepG2、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7及人肝永生化THLE-2细胞系，购自中科院上海生命科学研究院，RPMI 1640培养基、TRIzol和细胞裂解液均购自上海赛默飞世尔科技（中国）有限公司，20%胎牛血清购自上海语纯生物科技有限公司，胰蛋白酶购自上海雅心生物技术有限公司，兔抗人NEK7单克隆抗体购自美国Proteintech公司，MTT液购自上海泛科生物有限公司，ECL试剂购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司，PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司，NEK7引物购自北京三博远志生物公司，考马斯亮蓝和辣根标记山羊抗兔购自美国Sigma-Aldrich生物公司，PI-Annexin V FITC双标试剂盒购自美国BD公司。

1.2 靶向设计NEK7-shRNA

根据PubMed查询到的NEK7m RNA基因序列号信息（NM_133494.2），遵守RNAi总体设计原则，应用shDirectvershon2.0软件构建了三条NEK7-sh RNA寡核苷酸序列及阴性shRNA序列：shRNA-70：Sense-5’-CCGGATATGGGCTATAATACATT-3’,shRNA-269：Sense-5’-ACCATCCAAATGTAATAAAATAT-3’，shRNA-469：Sense-5’-GTCATGCATAGAGA TATAAAACC-3’，阴性shRNA序列：Sense-5’-TACTTTCTATCGTGACATAATGA-3’。以上序列均由上海吉玛生物制药技术有限公司合成及装载慢病毒转染载体。……