王 战， 王 麟， 姚 远， 刘 静， 孙桂荣， 刘明军

青岛大学附属医院 检验科， 山东 青岛 266003

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一种慢性的、胆汁淤积性的自身免疫性肝病[1-2]。患者在疾病早期往往没有明显的临床症状，诊断主要依靠血清胆汁淤积相关指标以及自身抗体的检测，由于出血和感染的风险，肝活检目前并不是PBC的常规诊断方法[3-4]。自身抗体作为一种相对无创的检测方法，具有较高的敏感度和特异度，在PBC的早期诊断中具有重要意义[5-6]。抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody，AMA)是PBC的特征性自身抗体。AMA包括9种亚型，其中AMA-M2亚型是诊断PBC最有意义的自身抗体[7]。除AMA-M2外，约1/3的PBC患者血清中可检测到核膜型或核点型的抗核抗体，如抗核孔膜蛋白抗体(gp210抗体)或抗核体蛋白抗体(sp100抗体)[3,8-9]。2017年欧洲肝病学会指南指出gp210抗体与sp100抗体对诊断AMA阴性的PBC患者具有较好的辅助作用[10]。因gp210抗体与sp100抗体对PBC的诊断特异度较高，可作为一种可靠的血清标志物，减少肝活检的必要性[5]。

目前，我国检测PBC相关自身抗体的主要方法为间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IIF)与免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)。上述两种方法均为定性检测，具有耗时长，操作繁琐的缺点，其结果依赖于操作者的临床经验及技术水平，具有较高的主观性[11]。随着实验室检测技术的不断发展，多重微球流式荧光免疫技术(multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay，MBFFI)，作为一种新型的自身抗体检测技术，以荧光编码微球为核心，能够实现自身抗体的高通量、快速和定量检测[12]，对疾病的诊断与病情评估具有重要意义。本研究将MBFFI定量检测AMA-M2、gp210、sp100 3种自身抗体的结果与IBT进行比较，进一步评估其对PBC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年8月—2020年6月于本院就诊并临床确诊的PBC患者340例(PBC组)，同时选取自身免疫性肝炎(AIH)患者81例与系统性红斑狼疮(SLE)患者62例作为其他疾病组。健康对照组选自于本院的健康体检者117例。PBC诊断依据2017年欧洲肝病学会临床实践指南[4]相关标准：(1)成年胆汁淤积的患者血清ALP水平升高，AMA滴度>1∶40；(2)AMA阴性患者血清中可检测到特异性抗核抗体(核点型或核膜型)；(3)除非患者缺乏PBC特异性自身抗体或合并AIH、非酒精性脂肪性肝病和其他全身性疾病，否则不建议用肝活检进行诊断。AIH诊断标准参照2019 年美国肝病学会实践指引和指南[13]：AIH 的诊断需要符合本病特点的肝组织学检查结果支持，并符合以下特征，(1)血清转氨酶水平升高；(2)血清IgG水平升高和/或一种或多种自身抗体阳性；(3)排除其他可导致慢性肝炎的病因，病毒性、遗传性、代谢性、胆汁淤积性，以及药物可能诱发类似AIH的疾病。SLE诊断依据2012系统性狼疮国际协作组的分类标准[14]，临床标准包括：急性皮肤性红斑狼疮、慢性皮肤性红斑狼疮、口腔溃疡、非瘢痕性脱发、滑膜炎或关节触痛和晨僵、肾脏受累、神经系统受累、溶血性贫血、白细胞或淋巴细胞减少、血小板减少；免疫学标准包括: 抗核抗体阳性，抗dsDNA抗体阳性、抗Sm抗体阳性、抗磷脂抗体阳性、低补体、直接Coombs实验阳性。符合4 项标准(至少符合 1 项临床标准和 1 项免疫学标准)可诊断为SLE。采取受试者空腹静脉血，低速离心后取上层血清，分两份于-36 ℃冰箱冷冻保存，检测前复融至室温。

1.2 研究方法

1.2.1 IBT检测 IBT检测试剂及EUROBlotMaster Ⅱ免疫印迹仪由欧蒙医学诊断公司生产，用于体外定性检测自身免疫性肝病IgG类抗体。本研究中膜条包被的抗原主要包括AMA-M2、gp210、sp100。检测方法：将膜条放入温浴槽中，按照1∶100加入稀释的样本血清，将膜条置于摇床上温浴30 min后洗涤；洗涤结束加入酶结合物温浴30 min，待充分反应后用已稀释的清洗缓冲液清洗膜条3次，5 min/次；最后加入1.5 mL底物液显色，待风干后应用EUROBLineScan 软件判读结果。所有操作均按照操作标准规程进行。

1.2.2 MBFFI检测 MBFFI检测的试剂及Luminex 200TM多功能流式点阵仪由上海透景生命科技有限公司提供。MBFFI检测方法：将待检血清于室温下复融，加载于TESMI F3999全自动加样仪上进行样本处理，应用Luminex 200TM流式点阵仪进行样本检测和数据处理[15]。本研究中3种自身抗体(AMA-M2、gp210、sp100)的cut off值为20 AU。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两种方法对同一种自身抗体检测结果的一致性应用Kappa检验,Kappa≥0.75表明两种方法检测的一致性较好，0.40≤Kappa<0.75 表明两种方法检测一致性一般，Kappa<0.40表明两种方法检测一致性较差。阳性率的比较采用χ2检验。受试者工作特征曲线(ROC曲线)应用Graphpad prism软件进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MBFFI与IBT检验一致性比较 应用MBFFI与IBT对所有样本血清中的AMA-M2、gp210与sp100抗体进行检测，每种抗体的检测阳性率与一致性见表1。两种方法检测的每种抗体的阳性率差异均无统计学意义(P值均>0.05)，一致率均>90.00%。计算两种方法检测的Kappa指数，本研究总体样本中两种方法检测一致性最好的抗体为AMA-M2(Kappa=0.895)。

2.2 MBFFI与IBT对PBC组患者血清自身抗体检测结果比较 应用MBFFI与IBT检测PBC组340例患者血清肝病相关自身抗体，其阳性率与一致性见表2。两种方法进行抗体检测的阳性率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。两种检测方法检测AMA-M2抗体的一致性最好(Kappa=0.874)；两种检测方法检测gp210与sp100抗体的一致性较好(Kappa值分别为0.713、0.749)。

2.3 MBFFI对AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体联合检测的诊断价值 以340例PBC患者为病例组，以其他疾病组与健康体检者为对照组，应用MBFFI联合检测血清AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体，该方法用于诊断PBC的敏感度、特异度等指标见表3。MBFFI对3种自身抗体单项检测时，AMA-M2抗体的敏感度(72.06%)最高。联合检测gp210与sp100两种抗体的敏感度高于该两种抗体的单项检测，联合检测AMA-M2、gp210与sp100 3种抗体的敏感度高于3种抗体的单项检测，而特异度小于单项检测。与单项检测AMA-M2抗体相比，3种抗体联合检测诊断PBC的误诊率略高但漏诊率降低。MBFFI单独及联合检测3种抗体的ROC曲线见图1。3种抗体单项检测时，AMA-M2抗体诊断PBC的ROC曲线下面积(0.850 3)高于gp210抗体(0.703 9)与sp100抗体(0.635 2)。3种抗体联合检测诊断PBC的ROC曲线下面积最大为0.907 0，gp210与sp100抗体联合检测的ROC曲线下面积高于gp210与sp100抗体的单项检测，但低于AMA-M2抗体的单项检测及3种抗体的联合检测。

表1 MBFFI与IBT检测所有样本总体一致性比较

表2 MBFFI与IBT对PBC组患者血清自身抗体检测结果比较

图1 MBFFI检测AMA-M2、gp210、sp100 3种抗体的ROC曲线

3 讨论

自身抗体的检测对于PBC的早期诊断具有非常重要的意义。AMA是PBC的标志性抗体，而gp210抗体与sp100抗体可出现在30%～50%的AMA阴性的PBC患者中。当患者血清中未检测出AMA，但具有PBC相关生化及临床表现时，可以通过检测gp210与sp100抗体来协助诊断PBC[16]。IIF是检测肝病相关自身抗体最广泛应用的方法，但其缺点在于结果判读易受人为因素影响[17]。随后出现的酶联免疫吸附试验、IBT等检测方法虽然克服了IIF的一些局限性，但仍然具有耗时长、操作繁琐、无法实现自动化等缺点[18]。随着实验室诊断技术的发展，MBFFI将不同颜色的荧光素按照不同比例与聚苯乙烯微球结合，构建100种带有可识别荧光的荧光微球。将100种荧光微球与抗原耦联，可对多种不同抗原抗体结合物进行检测，具有灵活性与多抗体性[17]。

本研究中应用MBFFI对所有血清样本中的AMA-M2、gp210、sp100抗体进行检测，其阳性率与IBT检测相差不大，一致性较好。在340例PBC患者中，MBFFI对AMA-M2、gp210与sp100抗体检测的阳性率与IBT大致相同，一致性较好。IBT为目前检测肝病相关自身抗体较为成熟且应用广泛的检测技术，本研究中MBFFI检测PBC特异性自身抗体与IBT一致性较好，且具有快速、自动化、高通量和定量检测等优势，因此MBFFI有可能成为临床常用的PBC相关自身抗体检测方法。相关研究表明应用MBFFI联合检测多种自身抗体可能提高诊断某些自身免疫性疾病的敏感度[12]，且其检测抗核抗体结果与IBT具有较好的一致性[15]，但尚未发现其他相关研究对MBFFI与IBT检测PBC相关自身抗体结果的对比评价。

表3 MBFFI检测AMA-M2、gp210与sp100抗体的诊断性能

本研究与Villalta等[19]应用INOVA诊断公司的一种基于微球的多重分析系统检测结果相比，应用该方法检测的AMA-M2、gp210与sp100抗体的敏感度分别为63.90%、23.70%、15.50%，均低于本研究所用的MBFFI方法，但其特异度较高，ROC曲线比较显示该研究检测3种自身抗体的ROC曲线下面积为AMA-M2 0.836、gp210 0.528、sp100 0.487。本研究的ROC曲线显示，AMA-M2、gp210与sp100抗体的ROC曲线下面积分别为0.850 3、0.703 9、0.635 2，均高于Villalta等的研究，检测结果的差异可能与地域和种族不同有关。此外，本研究发现AMA-M2、gp210与sp100 3种自身抗体联合检测诊断PBC的ROC曲线下面积更大，提示3种自身抗体联合检测对PBC具有更大的诊断价值，有利于与其他自身免疫性肝病相鉴别。相关研究针对亚洲PBC患者血清gp210与sp100抗体检测敏感度与特异度进行了分析，与亚洲人群检测上述两种抗体的平均敏感度与特异度相比[20]，MBFFI检测gp210抗体的敏感度较低而特异度高，检测sp100抗体的敏感度与特异度与平均水平一致。AMA-M2抗体与其他抗体相比在诊断PBC时具有较高的敏感度与特异度，本研究中当3种抗体联合检测时诊断PBC的敏感度要高于AMA-M2抗体的单项检测，且其漏诊率更低，提示3种抗体联合检测更有利于PBC患者的筛查与早期诊断。

综上所述，MBFFI对于AMA-M2、gp210与sp100 3种自身抗体的检测与IBT相比一致性较好。应用MBFFI联合检测3种自身抗体对诊断PBC的敏感度更高、诊断价值更大，有利于PBC的早期诊断。本研究还需要进行大样本和多中心的研究验证。MBFFI从方法学的角度优于IBT，能够快速、高通量的对样本进行定量检测，易于自动化与标准化，符合临床需求，具有重要的临床价值。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：王战负责标本收集，实验检测，收集资料，数据统计分析，文章撰写；姚远、孙桂荣参与资料整理和分析；王麟、刘静参与收集资料和数据统计；刘明军负责课题设计，拟定写作思路，指导文章撰写。