张民秀 谢芝勋 谢志勤 谢丽基 张艳芳 邓显文 曾婷婷 范晴 罗思思 黄娇玲

摘要：【目的】建立同時鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法，为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV（A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列，设计2套用于LAMP的特异性引物，并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe（5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQ3淬灭基团）和CIAV-Probe（5'端标记CY5荧光基团，3'端标记BHQ3淬灭基团）]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后，将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0 μL：DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作浓度40.0 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作浓度5.0 μmol/L）各0.4 μL，ALV-Probe（工作浓度0.5 μmol/L）0.4 μL，CIAV-Probe（工作浓度0.5 μmol/L）0.8 μL，以ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：62 ℃反应60 min，80 ℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV，对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/?L，检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/?L、CIAV的检测下限为103拷贝/?L。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测，其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV，具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点，且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察，适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。

关键词： 禽白血病病毒（ALV）;鸡……