方乐平 董振 樊卫飞

肺癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤之首。随着人口老龄化加剧，老年肺癌病人的数量和比重亦有所增加，现有超过1/3的新发肺癌病例年龄≥75岁[1]。肺癌病人预后差，在大多数国家，肺癌的5年生存率<15%[2]。很多老年人因无法耐受手术、化疗、放疗等抗肿瘤治疗，仅接受保守治疗，导致该类病人的预后更差。因此，筛选合适的指标来评估老年肺癌病人预后、指导治疗显得尤为重要。

转录因子激活蛋白-2(transcription factor activator protein-2，TFAP-2或AP-2)是具有细胞特异性的转录因子家族，它既调控正常机体的生长发育，又参与恶性肿瘤的发生发展[3-4]。TFAP-2在哺乳动物中由5个旁系同源物组成：TFAP-2a至TFAP-2e，分别编码蛋白质AP-2a至AP-2e。TFAP-2a在很多类型的肿瘤中表达异常，被认为与肿瘤的发生发展有着密切联系。但TFAP-2a在肺腺癌中的报道很少见，更未有对老年病人进行单独研究。本研究着眼于明确TFAP-2a在老年肺腺癌病人中的表达水平，并研究其与常见临床病理参数的相关性，为老年肺腺癌个性化治疗和预后评估提供理论支持。

1 资料和方法

1.1 基本资料

1.1.1 生物信息学数据库：本研究选取Gene Expression Profilling Interactive Analysis(GEPIA)数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)和Kaplan Meier-plotter(KMplot)数据库(https://www.kmplot.com/analysis/)。

1.1.2 组织标本：取自2015年8月至2020年3月连云港市第二人民医院手术切除的人肺组织的石蜡包埋标本库，共64例老年肺腺癌病人和25例老年肺部良性疾病病人(肺部良性疾病病人的肺组织标本为因病情需要行手术取得，为正常肺组织)。

纳入标准：(1)病人的原始资料完整；(2)病人术前均未接受任何抗肿瘤治疗；(3)病人均经病理学明确诊断，为原发的肺腺癌；(4)没有其他恶性肿瘤病史；(5)年龄≥60岁。排除围手术期死亡、手术前远处转移的病人。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学数据挖掘：在GEPIA数据库中输入TFAP-2a，可以得到TFAP-2a在全身诸多组织器官及对应肿瘤中的表达水平概览。点击Expression DIY，选择Box Plot，Datasets Selection (Cancer name)中选择LUAD，P值设为0.05，其余默认，即可生成TFAP-2a在肺腺癌组织和正常肺组织中的表达水平的箱式图。点击Expression DIY，选择Stage Plot，Datasets Selection (Cancer name)中选择LUAD，即可生成TFAP-2a在不同分期肺腺癌组织中的表达水平的柱状图。

登录KMplot数据库，点击mRNA RNA-seq模块中的pan-cancer分析，Gene Symbol中输入TFAP-2a，勾选Lung adenocarcinoma，Survival分析依次选择总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)，点击下方Draw Kaplan Meier plot，即可生成TFAP-2a与肺腺癌预后的折线图。

1.2.2 TFAP-2a表达测定：采用免疫组化法检测肺腺癌组织和正常肺组织中TFAP-2a的表达情况。4μm白片60 ℃烤片4 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。0.01 mol/L柠檬酸盐(pH 6.0)缓冲液高温高压修复2 min，3%的过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物酶的活性。1∶200 TFAP-2a一抗4 ℃过夜，1∶300二抗室温孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗。免疫组化试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

评分标准：(1)按阳性细胞数占同类细胞数的百分比计分：①0%～5%，0分；②6%～20%，1分；③21%～50%，2分；④51%～100%，3分。(2)染色强度评分：①无染色，0分；②低度染色(浅黄色)，1分；③中度染色(棕黄色)，2分；④强染色(棕褐色)，3分。总积分=染色范围积分×染色强度积分。结果判断：总积分≤4分为阴性，≥6分为阳性。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料以频数和百分比表示，采用卡方检验分析肺腺癌临床病理参数与TFAP-2a表达的相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学挖掘结果

2.1.1 GEPIA数据库中查询到的TFAP-2a的表达情况：肺腺癌组织中TFAP-2a的表达水平显著高于正常肺组织(P<0.05)，见图1。TFAP-2a的表达水平与肺腺癌的TNM分期无明显相关性(P>0.05)，但Ⅲ、Ⅳ期肺腺癌组织中TFAP-2a的表达有增高趋势，见图2。

注：*P<0.05

图2 GEPIA数据库中TFAP-2a在肺腺癌各分期中的表达情况

2.1.2 KMplot数据库分析TFAP-2a与肺腺癌预后的关系：KMplot数据库可以提取TFAP-2a的mRNA水平与肺腺癌预后的相关数据，对生存数据进行Kaplan-Meier分析。结果显示，TFAP-2a低表达的肺腺癌病人的RFS和OS相较于高表达病人明显获益，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 TFAP-2a mRNA表达与肺腺癌预后的关系

2.2 TFAP-2a在老年正常肺组织和老年肺腺癌组织中的表达情况 25份正常肺组织标本中，有6份TFAP-2a表达呈阳性，阳性率为24.0%；64份肺腺癌标本中，有44份TFAP-2a表达呈阳性，阳性率为68.8%。二者阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=14.62，P<0.01)。

2.3 TFAP-2a的表达与肺腺癌临床病理参数的关系 TFAP-2a的表达与老年肺腺癌病人的淋巴结转移、分化程度有相关性(P<0.05)，而与性别、吸烟情况、年龄、肿瘤大小及TNM分期无关(P>0.05)。见表1。

表1 TFAP-2a的表达与肺腺癌临床病理参数的关系(n)

3 讨论

近年来，肺腺癌发病率已超过肺鳞癌，成为发病率最高的肺癌，其总发病率约占原发性肺癌的50%，治疗手段主要包括手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等，临床多以综合治疗来提高治疗效果。TFAP-2a基因位于6号染色体短臂，编码合成含437个氨基酸的蛋白质，可通过与靶基因特定序列结合而调控靶基因转录，从而参与细胞的生长分化及发育。TFAP-2a基因在肿瘤信号传导中具有重要的调节作用，其在肺腺癌中的表达水平以及在肺腺癌的发生发展过程中是具有正性调节作用还是负性调节作用目前还存在较大争议。曾有研究发现，TFAP-2的过表达与细胞周期激活非小细胞肺癌(NSCLC)的发生有关[5-6]，而TFAP-2a可通过调节靶基因的表达激活上皮-间质转化(EMT)来促进肺腺癌的发生发展[2, 7]。另一方面，有研究发现TFAP-2a的下调可能与烟雾诱导的肺癌发生有关[8]。尼古丁可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和抑制TFAP-2a刺激人肺癌细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ的表达[9]。在治疗方面，TFAP-2a的表达水平与肺腺癌治疗中的化疗耐药性有关[10]，而且，Zhang等[4]发现TFAP-2a可通过促进肿瘤诱导的血管生成来加速对安罗替尼的抵抗。TFAP-2a也被报道可介导等位基因转录调节的DACT2基因来提高晚期肺腺癌中表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的疗效[11]。

本研究首先通过生物信息学技术来挖掘TFAP-2a基因和蛋白在肺腺癌中的表达水平。GEPIA数据库的分析结果显示，相较于正常肺组织，肺腺癌组织中TFAP-2a呈高表达，但与TNM分期无关；KMplot数据库的分析结果显示，高表达TFAP-2a的肺腺癌病人OS及RFS较低表达病人明显缩短。这些结果表明，TFAP-2a可能在肺腺癌中发挥促癌作用。分析TFAP-2a在老年肺腺癌组织与老年正常肺组织中的表达情况，发现TFAP-2a在老年肺腺癌组织中高表达的比例显著高于正常肺组织，但不同TNM分期肺腺癌病人的TFAP-2a表达水平差异无统计学意义。因此，笔者推测TFAP-2a可能也是诱导老年肺腺癌发生的一种主要蛋白。淋巴结转移、肿瘤分化程度与疾病进展程度和肿瘤的恶性程度均存在密切关系。本研究发现，TFAP-2a高表达在分化差、局部淋巴结转移的肺腺癌病人中比例更高。Liu等[2]发现TFAP-2a可诱导KRT16在肺腺癌中过表达，并且与淋巴结转移呈正相关。

综上所述，TFAP-2a在老年肺腺癌病人中高表达，且其表达水平与病人局部淋巴结转移、肿瘤分化程度密切相关。TFAP-2a的异常表达在老年肺腺癌的发生发展和病人预后中可能起重要作用，并且有希望成为治疗肺癌的新靶点。今后还需要借助大量的体内体外实验进一步阐明TFAP-2a在肺癌发生中的作用机制，为老年肺癌早期诊断、基因治疗、预后评估等提供新的思路。