李福利 刘捷凌 冷霞 孙晓柯 阮祥林

肺结核是结核分枝杆菌感染肺部引起的呼吸系统疾病，属于慢性传染病［1］。人体感染结核分枝杆菌不一定发病，90%以上的人群感染后可长期处于潜伏状态，但当机体抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，会引起临床发病［2］。因此，肺结核的发生发展不仅和结核分枝杆菌的数量和毒力有关，还与宿主自身免疫功能密切相关。现代免疫学研究也证实，复杂的细胞免疫调节系统与肺结核的病情发展有关［3］。粘膜相关恒定T 细胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）是体内高度保守的天然免疫T 细胞，在启动自身免疫活化，分泌效应分子对抗微生物感染中有重要的作用［4-5］。越来越多的证据表明，MAIT 细胞介导免疫反应在多种疾病的发生发展中有重要作用［6-7］。本研究将通过检测肺结核患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平，分析外周血MAIT 细胞功能与患者病情严重程度的关系，以期进一步明确MAIT 细胞与肺结核疾病进展的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2019年3月入院治疗的142 例肺结核患者作为肺结核组。纳入标准：①肺结核的诊断标准参考《肺结核诊断的治疗指南》［8］；②年龄＞18 岁；③患者及家属自愿参与，且签署知情同意书。排除标准：①抗结核治疗应用免疫调节剂；②合并恶性肿瘤、自身免疫系统疾病等；③严重心、肝、肾功能不全；④孕妇和哺乳期女性；⑤存在认知障碍和沟通障碍。同时选取45 例健康志愿者作为对照组。两组性别比例、年龄、体质指数比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究已通过医院伦理委员会审批。

表1 两组患者基线资料比较（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

表1 两组患者基线资料比较（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

组别肺结核组对照组t/χ2值P 值n 142 45性别（男/女）82/60 24/21 0.271 0.603年龄（岁）47.29±7.21 46.83±8.16 0.361 0.718体质指数（kg/m2）23.59±2.15 23.82±2.26 0.618 0.538

1.2 患者分组

肺结核患者入院后1 周内完成胸片或胸部CT检查，并了解其相关病例资料。根据患者肺结核的不同类型，分为初治组（n=68）和复治组（n=74）。根据影像学表现分组：①肺部病灶范围分组：A 组（1～2 个肺野）（n=62）、B 组（3～4 个肺野）（n=45）和C 组（5～6 个肺野）（n=35）；②肺部是否有空洞分组：空洞组（n=59）和无空洞组（n=83）。

1.3 检测方法

采集受试者空腹肘部静脉血5 mL，抗凝处理后，加入淋巴细胞分离液分离单个核细胞，分别加入CD3、CD8、CD161 抗体，常温下避光孵育30 min，清洗后上流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）进行检测，其中CD8+CD161+标记细胞即为MAIT。再分选上述MAIT 细胞（密度2×105个/mL），分别加入干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、颗粒酶B（Granzyme B）及白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）抗体，检测MAIT 细胞中IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17 的表达，流式抗体均购自美国Santa Cruz 公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，服从正态分布的计量资料以（）表示，方差齐性两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两分析采用SNK-q法；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较

肺结核组患者外周血MAIT 细胞比例、分泌IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 的MAIT 细胞比例显著低于对照组，分泌IL-17 的MAIT 细胞比例显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

表2 两组外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

组别肺结核组对照组t 值P 值n 142 45 MAIT 细胞（%）3.37±0.88 5.93±1.42 14.468＜0.001 IFN-γ（%）7.84±2.07 12.61±3.21 11.662＜0.001 TNF-α（%）3.45±1.10 5.37±1.62 9.025＜0.001 Granzyme B（%）1.43±0.42 2.37±0.65 11.337＜0.001 IL-17（%）5.24±1.56 3.73±1.14 6.000＜0.001

2.2 不同肺结核类型患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较

初治组和复治组患者外周血MAIT 细胞比例及其分泌细胞因子水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同肺结核类型患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

表3 不同肺结核类型患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

组别初治组复治组t 值P 值n 68 74 MAIT 细胞（%）3.46±0.92 3.21±0.80 1.731 0.086 IFN-γ（%）7.97±2.13 7.62±1.95 1.022 0.308 TNF-α（%）3.62±1.28 3.31±1.02 1.602 0.111 Granzyme B（%）1.49±0.48 1.38±0.35 1.569 0.119 IL-17（%）5.13±1.66 5.47±1.51 1.278 0.203

2.3 不同病灶范围患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较

不同肺部病灶范围患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中A 组MAIT 细胞及分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 水平均高于B 组和C 组，分泌IL-17 水平低于B组和C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 不同病灶范围患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

表4 不同病灶范围患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

注：与A 组比较，aP＜0.05；与B 组比较，bP＜0.05。

IL-17（%）4.65±1.42 5.53±1.78a 6.11±1.84a 9.485＜0.001组别A 组B 组C 组F 值P 值n 62 45 35 MAIT 细胞（%）3.81±1.02 3.29±0.75a 2.63±0.70ab 20.824＜0.001 IFN-γ（%）8.43±2.51 7.19±1.98a 6.32±1.82a 12.138＜0.001 TNF-α（%）4.37±1.35 3.16±1.02a 2.73±0.84a 27.624＜0.001 Granzyme B（%）1.73±0.52 1.32±0.41a 1.18±0.33a 20.242＜0.001

2.4 不同空洞表现患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较

空洞组和无空洞组患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 不同空洞表现患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

表5 不同空洞表现患者外周血MAIT 细胞及其分泌细胞因子水平比较（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

组别空洞组无空洞组t 值P 值n 59 83 MAIT 细胞（%）3.27±0.79 3.52±0.92 1.690 0.093 IFN-γ（%）7.71±1.84 8.05±2.26 0.952 0.342 TNF-α（%）3.31±0.95 3.62±1.18 1.669 0.097 Granzyme B（%）1.41±0.48 1.45±0.40 0.540 0.590 IL-17（%）5.53±1.43 5.11±1.72 1.536 0.127

3 讨论

1993年，MAIT 细胞首次在肠黏膜淋巴组织中被发现，其是一类表达半恒定T 细胞受体的T 淋巴细胞［9］。不同于传统T 淋巴细胞可表达多种T 细胞受体识别多种抗原，MAIT 细胞仅能限制性识别主要组织相容性复合体1b 分子，呈现出高度保守性［10］。MAIT 细胞起源于造血干细胞，在人体血液和肝脏内数量丰富，可参与抵抗病原体、肠道免疫、维持上皮细胞稳态等过程。

近年来研究显示，MAIT 细胞在宿主防御感染性病原体的免疫反应中有重要的调控作用，可能是天然的、抗感染、抗炎因素［11］。相关临床研究结果也显示，聚集于肠黏膜中的MAIT 细胞在肠炎疾病中具有保护性作用［12］。病原体入侵后，MAIT 细胞可以识别来源于细菌和酵母菌的抗原，活化后的MAIT 细胞可聚集于感染灶，可迅速分泌细胞因子，主要是IFN-γ 和TNF-α，杀伤受损的细胞，并调节树突状细胞等免疫细胞功能。MAIT 细胞是一种具有同源表型的细胞亚型，占人类外周血T细胞的1%～10%［13］。本研究结果这与既往研究报道感染性疾病患者外周血MAIT 细胞的数量减少相符［14］。但MAIT 细胞在肺结核患者肺组织中的表达情况还不清楚，后期将努力收集其肺组织样本，观察MAIT 细胞在感染部位免疫应答情况。

目前，MAIT 细胞对于铜绿假单胞菌、分支杆菌属的抗菌作用已在相关鼠类模型中明确，上述感染模型中MAIT 细胞数量减少，而细菌负荷增加［15］，但MAIT 细胞发挥抗菌活性的具体机制还不清楚。活化的MAIT 细胞可迅速分泌细胞因子及细胞毒性产物，包括IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17等。通过流式细胞术发现，肺结核患者外周血MAIT 细胞分泌细胞因子功能也发生改变，分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 等细胞因子能力减弱，而分泌IL-17 因子能力增强，这与报道指出MAIT 细胞在不同疾病中呈现的功能不同相符［16］。Böttcher 等［17］研究报道，MAIT 细胞在疾病状态中分泌的细胞因子由Th1 型转向Th17 型，与本文结果相符。本研究分析结果进一步说明MAIT 细胞及其功能与肺结核的进展密切相关。但本研究纳入病例数较少，后续将扩大样本量进行验证。

综上所述，肺结核患者外周血MAIT 细胞功能存在明显缺陷，病灶范围较广的患者MAIT 细胞功能缺陷更明显。但患者体内免疫调节网络是复杂、多面的，MAIT 细胞及其分泌因子在不同疾病状态下所起的作用也不尽相同。MAIT 细胞在肺结核中的作用机制尚未彻底明确，仍需进一步研究阐明其免疫机制。MAIT 细胞功能应用于肺结核病情判断和相关治疗将是本课题未来的研究方向。