赵海梅，靳燕婴，黄荣

(1.青海省海东市乐都区畜牧兽医站2.青海省刚察县动物疫病控制中心3.青海省畜牧兽医科学院)

生物体能够在生理和行为上适应昼夜节律[1]。哺乳动物的昼夜节律系统由分层多时钟结构组成，从分子、细胞到机体等不同层系上都表现出明显的时间周期现象[2]。Clock(circadian locomotor output cycles kaput)基因是生物钟家族重要的核心基因之一，广泛表达于视交叉上核以及外周组织。牦牛是青藏高原的重要家畜，对于高原的低温低氧极端环境有很好的适应性。由于这种极端环境的影响，使得牦牛与其他的牛种生理代谢水平有一定的差异。Clock作为动物生物钟家族的核心成员，可能参与牦牛适应复杂高原环境的代谢调控。因此，通过实时荧光定量PCR的方法，对牦牛不同组织中CLOCK基因表达进行比较研究，为生物钟基因在调控牦牛生理代谢功能研究中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所需的样品采集于西宁市本地屠宰场。分别采4头体型一致成年母牦牛下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉等样品，将采集的新鲜样品用生理盐水冲洗去血渍、切成小块并装入冻存管后立刻放入液氮速冻，运回实验室将样品转入超低温冰箱保存备用。

1.2 组织总RNA提取以及cDNA的合成

取0.5g组织样品在研钵中加入液氮磨碎，使用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)并根据说明书提取组织的总RNA，适量的无RNA酶水溶解。用核酸蛋白仪Nanodrop 2000检测RNA浓度，同时取6 μL提取的RNA用2%琼脂糖凝胶检测RNA的完整性。分装RNA并置于-80℃冰箱中保存备用。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，根据说明按步骤对提取的总RNA进行反转录得到cDNA，得到的cDNA可以进行常规PCR和RT-PCR。

1.3 引物的设计与合成

根据Genebank数据库中牦牛CLOCK(登录号：XM_014479222.1)基因和内参基因GAPDH(登录号：XM_014482068.1)mRNA序列，利用Oligo7.0软件设计荧光定量引物，并交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以下是CLOCK和GAPDH的引物序列：CLOCK(F:TAGTAACCGCTCCTGTAGCCTGTG,R:GCTGCTGCTGCGTGACTGAC，产物135bp)，GAPDH(F:ACCATCTTCCAGGAGCGAG,R:ATGATGACCCTCTTGGCGC，产物140bp)。

1.4 引物的特异性检验

应用常规PCR检测引物的特异性，反应体系：2×Taq Mix12.5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.5μL。反应程序：95℃ 预变性5 min，35个循环(95℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10 min。取5 μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，时间30 min。

1.5 RT-PCR

分别检测CLOCK基因在牦牛各组织的相对表达量。反应体系：SYBR Premix Ex Taq(2×)10μL(宝生物工程有限公司)，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Dye 0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 6μL。反应程序：95℃预变性30 s，(95℃变性5 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s)共35个循环，72℃ 10 min。每组实验4个技术重复，4个生物学重复。用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

1.6 数据处理

使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，不同时间点的数据用One-Way ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果

2.1 引物特异性

用卵巢cDNA模板分别扩增CLOCK和GAPDH目的片段，并对扩增产物经进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中清晰观察到目的产物在100bp附近，与所设计引物的目的产物CLOCK的135 bp和GAPDH的140 bp大小相一致，而且它们均为单一条带(图 1)，说明引物特异性高，可用于后续实验。

图1 卵巢CLOCK和GAPDH的扩增结果M：DNA标准；1-4：CLOCK；5-8：GAPDH M：DNA Marker ；1-4：CLOCK；5-8：GAPDH

2.2 RT-PCR检测目的基因和内参基因的特异性

以制备的卵巢cDNA模板，对CLOCK和GAPDH基因进行RT-PCR，分别得到CLOCK和GAPDH基因的溶解曲线。横坐标代表溶解温度(单位：℃)；纵坐标为溶解曲线反应的相对荧光读数(RFU值)即：温度变化速率/温度值。显示溶解曲线峰值单一，PCR产物Tm值相对汇合，表明引物特异性良好，PCR过程中没有非特异性扩增，排除了实验过程中出现假阳性的可能。综上所述，设计的引物可以准确的反应目的基因扩增时的相对表达量。

图2 牦牛卵巢Clock和GAPDH的溶解曲线

2.3CLOCK基因在牦牛各组织的相对表达量

分别提取母牦牛下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织mRNA，利用RT-PCR检测CLOCK基因表达量，GAPDH为内参基因。结果显示牦牛CLOCK基因在下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢以及肌肉中均有表达，且在肺脏和肾脏中高表达，在心脏中的表达量最低(表1，图3)。CLOCK基因在牦牛不同组织广泛表达，而且不同组织中含量差异显著。推测CLOCK基因在牦牛昼夜节律调控中发挥着重要的作用。

表1 牦牛不同组织CLOCK基因mRNA的相对表达量

图3 牦牛不同组织Clock基因mRNA的相对表达量

3 讨论

CLOCK基因在牦牛不同组织中的表达检测表明，CLOCK基因在下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉8种组织中都有表达，这与其它动物的检测结果相一致[9,10]。本研究结果表明，在相同实验条件下，牦牛不同组织内CLOCK基因的表达量存在有很大的区别，其中肾腺中CLOCK的表达量最高，心脏中的表达量最低。

下丘脑是调节昼夜节律的中央时钟，同时也是调节内分泌的重要枢纽。CLOCK基因在禽类下丘脑—垂体—性腺轴中参与生殖系统发育和繁殖性能的主要调控[11]。通过原位杂交发现，大鼠CLOCK基因主要表达在卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及黄体细胞中(Circadian clocks in the ovary)。卵巢的排卵具有自主节律，但是这种节律容易受到黄体激素的影响。我们观察到牦牛卵巢CLOCK基因表达量相较于除心脏以外的其他组织低，有可能与黄体激素的分泌相关。而有研究发现[12]，动物下丘脑中Clock基因的表达会随着年龄的增加而表达量和节律性出现降低的现象。本研究结果显示，在牦牛下丘脑中，CLOCK基因的表达量较低，可能是因为实验样品采自成年牦牛，其下丘脑的节律性调控作用减弱导致。在Clock基因与代谢功能的研究中，学者们发现敲除了Clock基因的小鼠会导致大量的胆固醇无法发生正常代谢而聚集在肝脏中，说明Clock基因参与肝脏代谢功能的调节[13]；心脏的心肌细胞在甘油三酯水平的合成及脂肪分解起着重要作用[14]。在本研究中，牦牛Clock基因在肝脏中的表达量高于心脏，这可能是肝脏和心脏所行使的代谢机能不同所致。作为主要的免疫器官，Clock基因在脾脏存在表达，且表达量较高，这提示了在牦牛中，Clock基因可能参与机体免疫功能的调节。在研究结果中发现，Clock基因在牦牛的肺脏和肾脏都有着较高的表达量，而肾脏中的Clock基因表达量最高，由此可推测Clock基因可能在牦牛的泌尿功能上参与调节。在其它动物上，Clock基因被证实存在于性腺组织中，并参与调控动物的生殖代谢[11]。在本试验中，我们检测出牦牛卵巢中存在Clock基因，这为今后研究该基因在牦牛卵巢中激素分泌及卵泡发育功能提供依据。此外，本研究显示Clock基因在牦牛肌肉的组织中有着较高的表达，揭示Clock基因可能在牦牛调节肌肉节律性活动中具有一定的调节作用。

Clock基因的这种不同组织的相对表达差异也在其它物种中表现：Liu[14]等在鼠的研究中发现，Clock基因在鼠的肝脏的表达量高于脾脏的表达量；而在鸡的组织中，胸肌的表达量最高，肾脏、心脏、下丘脑中度表达，肝脏、肠道、卵巢低度表达[9]。实验的结果也显示，不同牦牛组织中，Clock基因的表达量存在一定的差异，这可能取决于基因在不同组织中所参与的调控功能的差异有关，具体功能机制还需进一步研究。