秦红霞，胡文彬，高梦瑶

(郑州大学第一附属医院 口腔科，河南 郑州 450052)

口臭是用来表示呼吸或说话时从口腔呼出的异常气味的术语。测量口臭的最基本方法是感官评分(organoleptic scoring，OLS)，尽管这种方法具有主观性且缺乏可重复性，但这种方法仍然是金标准，因为人的鼻子可以分辨出最多种类的不同气味[1]。口臭的病因相当复杂，口臭患者常被发现就诊于口腔科。由于评估方法的不同，口臭的患病率也不同，口臭可分为口外口臭和口内口臭[1]。80%～90%的口臭源于口腔，舌苔和牙周状况是最重要的风险因素[2-3]。造成口腔异味的主要化合物是挥发性硫化物(VSCs)，如硫化氢(H2S)、甲硫醇(CH3SH)和二甲基硫醚(CH3SCH3)[4]。

牙周炎是发生在牙周组织的一种慢性感染性疾病，是宿主防御机制与菌斑微生物相互作用的结果。牙齿表面生物膜中的微生物群落在牙周炎的发生发展中起到了重要的作用。Dhanani等[5]发现了口臭和牙周病之间可能的关系，即牙周袋中VSCs产量增加，这为牙周病患者口腔异味的加剧提供了一个合理的解释。牙周炎能够加重口腔异味的严重程度，也可能是由于可供细菌新陈代谢的底物数量增加[6]。在牙周炎患者中，上皮细胞的脱落和白细胞的渗出可以产生更多的含硫蛋白底物。Yegaki等[7]发现，探诊出血和牙周袋深度与VSCs的产生呈正相关。

借助16SrRNA基因测序方法已经能够对复杂的细菌群落进行全面的调查。有口臭的受试者的微生物群落比无口臭的受试者的微生物群落的多样性更大，并且各种微生物均与口臭有关[8]。因此，本研究的目的是利用16SrRNA基因测序技术，对典型牙周炎伴口臭患者的唾液样本以及牙周炎不伴口臭患者的唾液样本与健康对照组进行分析，比较伴或不伴口臭的牙周炎患者的菌群结构及优势菌差异，分析菌群和口臭之间可能的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象于2020年9月至2021年1月就诊于郑州大学第一附属医院牙周科的患者中随机选取3例牙周炎伴口臭者(H组)，3例牙周炎不伴口臭者(P组)，另外选取3名健康对照者(N组)。研究对象均签署知情同意书。

1.2 相关标准

1.2.1OLS评分标准 0表示无口臭；1分表示可疑口臭；2分表示轻微但明确的口臭；3分表示中度口臭；4分表示重度口臭，但可以忍受；5分表示恶臭。

1.2.2纳入标准 受试者年龄>16岁。(1)牙周炎伴口臭患者：①口腔内来源的口臭；②OLS≥2分；③牙周探诊深度(probing depth，PD)≥4 mm。(2)牙周炎不伴口臭患者：①OLS≤1分；②PD≥4 mm。(3)健康对照者：①OLS≤1分；②PD≤3 mm；③探诊出血(bleeding on probing，BOP)阴性。

1.2.3排除标准 (1)开放性龋损；(2)妊娠；(3)与口干燥症相关的全身药物治疗；(4)前3个月内接受全身抗生素治疗；(5)吸烟；(6)胃食管反流；(7)全身系统性疾病，如呼吸道疾病、糖尿病、肾病、肝病、胃病、艾滋病等。

1.3 样本采集及检测方法受试者在采集样本前被告知：(1)在评估前48 h勿食用含有洋葱、大蒜类的食物；(2)采集样本前12 h内不得饮用含有酒精的饮料；(3)检查当天食用清淡的早餐，饭后刷牙以清除牙菌斑沉积物和食物残渣，不清洁舌头；(4)在进行检查的同天早上，勿使用有香味的化妆品。取样前对2名检查者进行培训并进行内部一致性检验，Kappa值为0.67，内部一致性较好。对口腔进行临床检查后，收集和制备唾液样本。采样时，嘱受试者清水漱口后闭口呼吸30 s，然后采集3～5 mL非刺激性唾液于15 mL无菌离心管中，-80 ℃储存，直到进一步处理。采集到牙周炎伴或不伴有口臭患者和健康对照唾液样本共9份。进行DNA提取以及16SrRNA基因库制备和测序。

1.4 统计学方法通过Illumina NovaSeq测序平台完成数据统计及生物学信息学分析。首先对测序得到的原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，然后基于有效数据进行运算分类单位(operational taxonomic units，OTUs)聚类和物种分类分析；α、β多样性指数组间差异分析通过Tukey和Wilcoxon秩和检验分析组间物种多样性差异是否显著。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本菌种OTUs9份样本共检测出770个OTUs。在门水平上，主要检测出拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门、螺旋体门。在属水平上，主要检测出普氏菌属、韦荣菌属、拟杆菌属、奈瑟菌属、放线菌属、嗜血杆菌属、直肠无水杆菌属、链球菌属、梭杆菌属、小杆菌属。见图1。

A为门水平样本中丰度排名前十的微生物；B为属水平样本中丰度排名前十的微生物。

2.2 α多样性分析(1)如图2所示，3组样本的稀释曲线均趋于平缓，表明本实验OTUs的测序数量足够。3组观测数目比较，差异无统计学意义(P>0.05)。但是N组与P组的OTUs数目较H组多。(2)通过比较Shannon指数发现，H组微生物群落多样性高于N组(P<0.05)；P组微生物群落多样性与N组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。(3)通过比较Simpson指数发现，H组和P组菌群多样性大于N组，H组菌群多样性大于P组(P<0.05)。见图4。

图2 样品丰富度稀疏曲线

*P<0.05。

*P<0.05；**P<0.01。

2.3 β多样性分析

2.3.1PCoA主成分分析 如图5所示，N组3例样本(N1、N2、N3)分布较为集中，而右上象限主要集中分布了P2、P3以及H3样本，左上象限包括了H2和P1样本，但分布较为离散，左下象限内只有H1样本。置换多因素方差分析(ADONIS)显示：N组与H组之间分组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；N组与P组之间分组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；P组与H组之间分组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图5 PCoA主成分分析

表1 ADONIS分析组间差异

2.3.2LDA Effect Size(LEfSe)分析 为了更具体地鉴定与牙周炎和口臭相关的菌群，进行了LEfSe分析，线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)得分>4分，P<0.05。3组样品的优势菌如图6所示。N组嗜血杆菌属表现出相对较高的丰度。而梭杆菌门、梭杆菌属在H组中表现出较高的丰度。P组与N组和H组相比，未检测到差异明显的优势菌群。

图6 LDA分值柱状图

3 讨论

目前已经通过不同的方法发现了许多与口臭有关的细菌。本研究发现，细毛菌属的相对丰度在牙周炎伴口臭患者中更明显，这与Takeshita等[9]发现一致。本研究中3组样本的主要检出菌集中在普氏菌属、韦荣菌属、拟杆菌属、奈瑟菌属、放线菌属、链球菌属、梭杆菌属、小杆菌属。这提示牙周炎伴口臭患者、牙周炎不伴口臭患者与健康人之间的菌群多样性差异主要是由菌群结构不同引起的，与Riggio等[10]得出的结论相似。Riggio等[10]认为口臭与健康人菌群多样性之间的差异是数量上的，而不是质量上的。与口臭密切相关的有小杆菌属、梭杆菌属、卟啉单胞菌属、奈瑟菌属等，而公认的VSCs的产生菌如牙龈卟啉单胞菌、梭杆菌均在牙周炎伴口臭患者中检测到较高的丰度。其中，梭杆菌属为牙周炎伴口臭组的优势菌。

对舌部微生物群的细菌16SrRNA基因进行焦磷酸测序研究后发现，细毛菌属和普氏菌属均与高H2S水平有很强的相关性，而嗜血杆菌和孪生菌与H2S水平呈负相关[11]。本研究结果显示，细毛菌属和普氏菌属在牙周炎伴口臭患者中的检出率较高，同时嗜血杆菌在健康者和口臭及牙周炎患者的检出丰度存在显著差异，嗜血杆菌属是健康组的优势菌，与上述结论[11]相似。Takeshita等[8]发现产生高水平H2S和CH3SH的菌群结构也不相同，高H2S组梭杆菌属、奈瑟菌属、卟啉单胞菌属和SR1属的优势明显高于其他组，高CH3SH组普氏杆菌、韦荣菌、阿托波菌、巨型单胞菌和单胞菌的优势明显高于其他组。这表明不同的细菌种群参与了口腔中不同化合物的产生过程。

根据菌斑的聚集特性以及牙周状况，将牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌以及齿垢密螺旋体归为红色复合体。该复合体与牙周炎密切相关，尤其是牙周袋的深度。在本研究中，通过16SrRNA分析在牙周炎组和口臭组中均发现了属于红色复合体的卟啉单胞菌属、拟杆菌属、螺旋体属，以及属于橙色复合体的奈瑟菌属、TM7、放线菌属和梭杆菌属，而这些细菌的检出率在健康组中极低。这表明牙周炎红色复合体和橙色复合体在口臭的产生上发挥了重要作用。

借助16SrRNA技术不仅检测到了口腔内的常见菌群，也可以检测到一些尚不能在体外进行培养的菌群。这种高通量测序方法可以大量检测到口腔内丰富的菌群，对口腔菌群的研究发挥了重要作用。本研究的局限性在于，未跟踪经过牙周治疗后口臭患者的口臭评分以及口内菌群的变化，而增加口臭患者前后治疗对比的数据将会使本研究结果更加具有可信度。虽然样本量较少，但纳入对象均有典型的临床体征，所以具有一定的代表性和可信度。今后会加大样本量，进一步深入研究，以准确地了解牙周炎伴或不伴口臭患者的唾液微生物菌群多样性以及结构的差异，分析菌群和口臭两者的相互关系。