姜磊 张睿 马笑影 高肇妤 崔冬生 许顺江

(河北医科大学第一医院中心实验室 河北省脑科学与精神心理疾病重点实验室，河北 石家庄 050000)

miRNAs是一类长度为20～24个核苷酸的内源性非编码小RNA，主要在转录后水平调控基因表达〔1〕。miRNAs在阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病的发生发展中具有重要的调控作用〔2〕，且miRNAs可能作为AD诊断的标志及治疗的新靶点〔3〕。miRNA芯片能够克服单基因研究的缺点，在功能基因组学研究中有广泛的用途，从整体上分析细胞或组织之间的差异。本实验通过miRNA芯片技术，分别筛选原代培养的海马神经元和氧化应激的海马神经元及正常老化小鼠(SAMR1)和速老化小鼠(SAMP8)海马组织差异表达的miRNAs，并对这些miRNAs进行qPCR验证及生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1实验材料 3月龄SAMR1和3月龄SAMP8购自北京大学医学部动物中心。两种小鼠饲养于河北医科大学第四医院动物中心。本实验所有操作程序经河北医科大学第一医院伦理委员会批准。DMEM/F12培养基、胎牛血清、B27均购于美国Invitrogen公司。H2O2、胰蛋白酶、左旋多聚赖氨酸、Hoechst33258购于美国SIGMA公司。甲臜化合物(MTS)购于美国Promega公司。微管相关蛋白(MAP)-2一抗购于美国BD公司。驴抗鼠荧光二抗购于美国Abbkine公司。miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒购于中国TIANGEN公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 使用75%乙醇浸泡消毒整个SAMR1新生鼠后，放入超净工作台的弯盘中断头取脑，在磷酸盐缓冲液(PBS)中快速分离海马组织。将剔除脑膜和血管的海马组织剪成1 mm3左右的碎块。向碎块中加入0.125% 胰酶，37℃作用10 min。……