赵利芳 杨建功

(新乡市中心医院麻醉与围术期医学科，河南 新乡 453000)

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤细胞SHG139和U87购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基购自美国Gibico公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养与分组 胶质瘤细胞SHG139和U87用RPMI-1640培养基常规培养，分别用终浓度为0、15、30、60 μg/ml的Mida处理，作为Mida组，正常培养的细胞作空白对照(NC)组，将miR-con、miR-33a-5p转染至SHG139和U87细胞，记为miR-con组、miR-33a-5p组；将anti-miR-con和anti-miR-33a-5p分别转染至60 μg/ml Mida处理的SHG139和U87细胞中，记为Mida+anti-miR-con组、Mida+anti-miR-33a-5p组。

1.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-33a-5p和同源盒蛋白(Six)1 mRNA表达水平 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，miR-33a-5p和Six1分别以U6和β-actin为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.4Western印迹检测Six1、增殖细胞核抗原(PCNA)和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3的表达 提取各组总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，曝光显影，定影，分析蛋白条带的吸光度，计算蛋白表达水平。

1.5MTT检测细胞活性 各组细胞培养48 h，按试剂盒说明书操作，酶标仪检测570 nm处吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 将转染后的各组SHG139、U87细胞以每孔200个细胞接种于6孔板，每隔2 d换液1次，并观察细胞形态，克隆形成以绝大多数单个细胞数大于50为止。克隆形成后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再用4%的多聚甲醛室温固定30 min，吸去固定液用吉姆萨染液染色10 min，水洗风干后，显微镜观察下拍照计数。……