吴启仙,宁红平,吴兴辉,李厚成

目前，CO中毒发病率和病死率较高[1]。大气中CO的正常浓度<0.001%，当CO浓度为0.1%时可能致命。急性CO中毒会引起严重的神经系统损伤[2]。许多研究表明，免疫和炎症反应在CO中毒后的脑损伤中起重要作用。糖原合成激酶-3β(GSK-3β)在中枢神经系统退行性变中起关键作用。有人提出将GSK-3β失活作为促进神经元存活的机制[3]。药理学抑制剂或RNA干扰诱导的GSK-3β耗竭足以阻止谷氨酸诱导的兴奋性毒性和所产生的神经保护作用。TDZD-8是一种GSK-3β抑制剂，缩小了脑缺血损伤后的梗死体积。最近研究表明，在自身免疫性疾病、帕金森病、出血性脑损伤等疾病中GSK-3β表达上调[4]。信号转导及转录激活因子3(STAT3)是参与诱导炎性介质的关键调节因子。CO中毒所致的脑损伤与脑部的炎症反应密切相关[5]：GSK-3β易位进入细胞核并调节与炎症反应相关的基因转录，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6。因此，减轻炎症反应是急性CO中毒的主要治疗方法之一。本研究探讨靶向调节GSK-3β基因对急性CO中毒大鼠脑损伤的保护作用，为急性CO中毒脑损伤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，18周龄，体质量310～360 g，由中国北京生命河实验室提供，生产许可证号：SCXK(京)2020-0006，动物使用许可证号：SYXK(京)2020-0012。大鼠圈养在12 h明/暗循环中，温度18～22 ℃，湿度40%～70%，自由进食啮齿类动物饲料和水。将大鼠随机分为正常对照组、CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组，每组20只。

1.2主要药品、试剂与仪器 GSK-3β基因过表达的慢病毒(LV-GSK-3β，批号：qw-2098239.13)、空白慢病毒(LV，批号：982737818.3)均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；ProOx-820动物实验高压氧舱(天津合普)、DS-09水迷宫实验台(上海移数信息科技有限公司)、苏木素-伊红(HE)试剂盒(中国碧云天生物科技，批号：CV-59653.36)、TUNEL法(美国OriGene Technologies生物科技，批号：CB-54893.63)、BX50光学显微镜(日本Olympus Corporation)、Trizol试剂(美国Invitrogen，批号：ED-85463.36)、PrimeScript RT逆转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司，批号：CE-4586.36)、ABI 7900系统(美国Applied Biosystems公司)、SYBR Green Master PCR试剂盒(中国碧云天生物科技，批号：SD-45896.36)、总蛋白提取试剂盒(北京Solarbio科学技术有限公司，批号BC3640-50T)；二辛可宁酸测定试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific，批号：2322.635)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，Bio-Rad Laboratories,批号：DE-4789.36)、PVDF膜(美国EMD Millipore，批号：RT-7485.63)、BSA(美国Sigma-Aldrich，批号：RT-741.369)；抗GSK-3β一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab37150)、抗STAT3一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab38898)、抗β-actin一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab8227)、辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000，美国Abcam，批号：ab6721)、ECL化学发光试剂(德国Hanbio Biotechnology Co，批号：CD-48586.36)。

1.3模型制备 CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组大鼠于ProOx-820动物实验高压氧舱吸入CO气体，先暴露于1000 mg/L的CO气体40 min，然后再暴露于3000 mg/L的CO气体20 min；当大鼠碳氧血红蛋白(HbCO)浓度>40%，且意识不清说明CO中毒模型制备成功。建模成功后，慢病毒空白组通过10 μl Hamilton注射器将0.25 μl 的 LV-EGFP 稀释液(4×106TU病毒颗粒)注射到大鼠双侧海马体中；G……