晏 群 李 栩 李沛城 冯 波

2013年流行病学调查的数据显示，中国成人糖尿病患病率为11.6%，糖尿病前期患病率高达50.1%[1]；近期中国成人糖尿病和糖尿病前期的患病率分别为12.8%和35.2%[2]，提示我国糖尿病患者呈快速增多趋势，积极预防刻不容缓。与正常葡萄糖耐量(normal glucose tolerance，NGT)人群相比，糖尿病前期，尤其是葡萄糖耐量异常(impaired glucose tolerance，IGT)者患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的风险更高。对IGT人群进行早期干预可显著降低其罹患T2DM的概率。有效的干预措施包括改变生活方式和药物治疗。现已证实，生活方式的改变能有效预防IGT发展为T2DM。二甲双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类等药物治疗也被证实可预防IGT发展为T2DM[3-5]。然而，在临床实践中，自然人群中非糖尿病患者使用降糖药物降低糖尿病发生率的依从性相对较差。因此，在改变生活方式的基础上，以非降糖药物来预防糖尿病前期患者向T2DM发展，成为了研究的新方向。

糖尿病患者存在肠道菌群的改变，而肠道菌群失调与糖代谢异常的发生密切相关[6-7]。糖尿病患者肠道益生菌群减少，人为补充益生菌能否缓解和改善糖代谢异常？目前已有的关于补充益生菌治疗代谢性疾病的临床证据有限，且结果不一致[8-14]，而上述研究的干预时间均较短，可能无法观察到益生菌的效果。本研究旨在探讨补充益生菌对预防IGT患者向T2DM转化的有效性和安全性，以及益生菌对胰岛素敏感性、代谢变量和不良事件发生的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2014年9月—2016年9月在同济大学附属东方医院内分泌科门诊初步筛查为IGT的患者106例，经口服75 g葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test, OGTT)明确为IGT的患者77例，其中男33例、女44例；年龄范围35～65岁，年龄为(55.8±11.9)岁。所有患者治疗期间均不使用治疗IGT的药物。排除标准：①患有严重肝、肾、心脏、神经系统疾病；②已确诊糖尿病；③对益生菌药物及其组成成分过敏；④怀疑或有酒精、药物滥用史；⑤近3个月参加过其他临床试验观察。根据WHO 1999年[15]的标准诊断IGT、T2DM和NGT。本研究经医院伦理委员会审核和批准(伦理号为2013-009)，所有患者均签署知情同意书，且在中国临床试验研究网注册(临床试验注册号：CHICTRC13004024)。

1.2 方法 本研究为随机、双盲、安慰剂对照试验。采用随机数字表法将IGT患者分入益生菌组(44例)和安慰剂组(33例)。益生菌组给予益生菌(含双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌)口服，2次/d，每次2粒；安慰剂组给予安慰剂(主要成分为淀粉，外包装与益生菌完全相同)口服，2次/d，每次2粒。益生菌和安慰剂均为上海信谊制药公司产品。两组均随访2年，第1年每3个月和第2年每4个月进行75 g OGTT，评估患者的糖代谢状况。所有患者均于干预前采集完整病史，包括近3个月内所有服用的药物；分别于干预前和干预后(随访结束时)进行体格检查，测量血压、心率、身高、腰围、体重等；75 g OGTT和同步胰岛素释放试验均于清晨空腹状态下进行，空腹采血测定血脂水平、肝肾功能等。收集所有患者干预前、后粪便标本(益生菌组26对，安慰剂组24对)进行肠道菌群测定。

1.3 肠道菌群检测 应用16S rDNA测序技术检测肠道菌群结构的组成及丰度。使用上游引物338F(5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和下游引物806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。回收PCR产物，应用Miseq PE300/NovaSeq PE250平台(美国Illumina公司)进行测序。

1.4 观察终点 主要终点为随访2年内两组间T2DM累积发生率的差异。次要终点为两组间NGT患者比例，FBG、服糖后30 min血糖(30mPG)、服糖后2 h血糖(2hPG)水平，空腹胰岛素(FINS)、服糖后30 min胰岛素(30mINS)、服糖后2 h胰岛素(2hINS)水平，血脂水平和体重的变化，以及益生菌的安全性，可能的菌群比例的变化。

肠道菌群数据处理：应用Fastp软件对原始测序序列进行质量控制，应用Flash软件进行拼接，使用UPARSE软件根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。应用RDP classifier(version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库，设置比对阈值为70%。组间及组内菌群的比较采用秩和检验，校正P<0.013为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组干预前基线资料比较 两组间患者的年龄、男性患者比例、BMI、腰围、心率、收缩压、舒张压，ALT、γ-谷氨酰转肽酶、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG、2hPG、FINS水平，以及HbA1c、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 两组患者干预前基线资料的比较

2.2 两组干预后(随访结束时)临床资料比较 在随访过程中，益生菌组有3例患者提前退出(2例因长期外出不能参加随访，1例餐前有低血糖症状)，安慰剂组有2例患者提前退出(1例头痛,1例腹泻)，总脱落率为6.5%。益生菌组、安慰剂组分别有41、31例患者完成随访，纳入分析集。干预后(随访结束时)，益生菌组患者BMI显著大于安慰剂组(P=0.018)。两组间其他临床资料和新发T2DM、NGT患者比例的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

表2 两组患者干预后(随访结束时)临床资料和新发T2DM、NGT患者比例的比较

2.3 Kaplan-Meier生存曲线分析 益生菌组随访2年内的T2DM累积发生率为48.9%， 安慰剂组为41.9%，两组间T2DM累积发生率的差异无统计学意义(P=0.861)。见图1。

图1 两组随访2年内T2DM累积发生率的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 两组干预前后血糖、胰岛素和血脂水平比较 与干预前相比，两组患者干预后(随访结束时)的FBG水平显著降低[(5.7±0.7) mmol/L 比(5.4±0.7) mmol/L,P=0.001],30mINS水平显著升高[53.2(37.3,63.3) mU/L比59.2(46.1,75.9) mU /L,P=0.020]，2hINS水平有所降低[98.7(74.9,116.2) mU/L比70.5(61.2,87.5) mU/L，P=0.05]，30mPG、2hPG和FINS水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。两组间干预前后血糖、胰岛素、HOMA-IR、TG、TC、HDL-C、LDL-C变化值的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表3。

表3 两组干预前后血糖、胰岛素及其他代谢指标变化值的比较 [M(P25，P75)]

2.5 两组干预前后肠道菌群变化 组间比较：干预前,益生菌组与安慰剂组组间优势菌群(相对丰度前15的菌属) [如霍氏真杆菌属(Eubacterium

hallii)、Blautia属、Subdoligranulum属等]所占比例的差异无统计学意义(P值均>0.013)，仅劣势菌群瘤胃球菌属(Ruminococcusgauvreauii)所占比例的差异有统计学意义(OR=-0.21，95%CI为-0.53～0.03，P=0.001)。干预后，益生菌组与安慰剂组组间优势菌群[如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、霍氏真杆菌属、Blautia属等]所占比例的差异无统计学意义(P值均>0.013)，仅劣势菌群卡氏伯克霍尔德菌-副伯克霍尔德菌属(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，OR=0.50，95%CI为-3.20～5.12，P=0.012)、产丁酸菌属(Alistipes，OR=-0.22，95%CI为-0.37～0.09，P=0.007)所占比例的差异有统计学意义。组内比较：与同组干预前相比，益生菌组干预后优势菌群各菌属所占比例的差异均无统计学意义(P值均>0.013)，仅劣势菌群乳杆菌属(Lactobaciuus，OR=0.23，95%CI为-0.70～1.41，P=0.012)、挑剔真杆菌属(Eubacteriumeligens，OR=0.09，95%CI为0.01～0.21，P=0.012)所占比例显著增高。安慰剂组干预前与干预后各菌属所占比例的差异无统计学意义(P值均>0.013)。见图2。

A 两组干预前菌群占比比较 B 两组干预后菌群占比比较 C 益生菌组干预前后菌群占比比较 D 安慰剂组干预前后菌群占比比较图2 两组干预前后组间及组内优势菌群占比比较

2.6 Cox回归分析IGT向T2DM转化的影响因素 以是否行益生菌干预、年龄、BMI、腰围、血压、肝功能、血脂、HOMA-IR为协变量，纳入Cox回归模型分析，结果显示，益生菌干预(HR=0.98，95%CI为0.39～2.46)、年龄(HR=1.00，95%CI为0.97～1.04)、BMI(HR=0.91，95%CI为0.74～1.13)、腰围(HR=1.01，95%CI为0.95～1.08)、收缩压(HR=1.02，95%CI为1.00～1.05)、舒张压(HR=0.95，95%CI为0.90～1.01)、ALT(HR=1.01，95%CI为0.99～1.03)、γ-谷氨酰转肽酶(HR=1.00，95%CI为0.99～1.01)、TG(HR=1.67，95%CI为0.63～4.46)、TC(HR=0.23，95%CI为0.01～4.13)、HDL-C(HR=3.42，95%CI为0.25～47.60)、LDL-C(HR=4.42，95%CI为0.24～80.20)、HOMA-IR(HR=1.09，95%CI为0.96～1.23)均不是IGT向T2DM转化的影响因素(P值均>0.05)。

2.7 两组不良反应情况比较 安慰剂组、益生菌组不良反应发生率分别为9.1%(3/33)、0，两组间的差异无统计学意义(P=0.075)。安慰剂组发生不良反应的3例患者中，1例诉服药后头痛，停药后自行好转；1例诉服药后腹泻1周，停药后好转；1例因白内障手术住院治疗，好转后出院。

3 讨 论

肠道菌群失调与肥胖、糖尿病的发生、发展密切相关，其表现为肠道菌群丰度减少、拟杆菌门增多，以及厚壁菌门减少、细菌代谢产物丁酸盐减少等[6-7]。肠道菌群受饮食、药物、年龄、性别等多种因素影响。来自人类和动物的研究[16-18]结果表明，肠道微生物组是介导减肥手术、饮食控制和降糖药物治疗效果的共同途径。因此，重塑肠道菌群可能是人类防治糖尿病的一个新的研究方向。本研究通过补充包含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的活性益生菌或安慰剂对IGT患者进行干预，结果显示，益生菌组与安慰剂组的T2DM累积发生率的差异无统计学意义，提示益生菌在预防IGT向T2DM转化方面并不占优势。

益生菌可能对宿主有多种影响，包括促进营养物质(如乳糖)的消化和代谢，或通过胆盐产生全身效应，直接或间接抵抗病原体，改善肠道屏障功能，改变微生物组结构和神经系统信号，进行免疫调节等[19]。关于益生菌或益生元改善代谢相关指标的研究较多但结论不一。口服含嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的益生菌酸奶可改善T2DM患者的FBG、HbA1c水平和抗氧化状态[8]。另有两项研究[9-10]结果表明，合生元或益生菌干预仅改善T2DM或妊娠期糖尿病患者的脂质代谢，并不能改善FBG水平。近期发表的一项研究[20]结果表明，单纯给予益生菌干预12周，T2DM患者的HbA1c无改善。在关于补充益生菌或益生元对糖尿病前期患者血糖的研究[11-14]中，均未发现补充益生菌可改善血糖水平或HOMA-IR。日本学者对48例肥胖的糖尿病前期男性患者予口服含干酪乳杆菌菌株牛奶8周后发现,服用益生菌牛奶可降低患者TC、LDL-C及非HDL水平，但未改善2hPG[11]。北欧学者对21例超重或肥胖的糖尿病前期患者予低聚半乳糖补充治疗12周，发现补充低聚半乳糖显著增加了肠道双歧杆菌含量，但仍未显著改善HOMA-IR[12]。在一项关于青少年糖尿病前期患者的研究[13]中,未观察到口服益生菌4个月后可改善FBG和HbA1c。新西兰学者通过对33例糖尿病前期患者予间歇断食和补充乳杆菌或安慰剂12周后，未观察到补充乳杆菌组患者FBG、HbA1c及血脂代谢指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C)有改善[14]。但上述这些研究的观察时间均较短，是否会影响益生菌的有效性尚待验证。在本研究中，虽然在随访结束时观察发现所有受试者在服糖后胰岛反应功能有所改善，但两组间FBG及服糖后的血糖、胰岛素水平的差异无统计学意义。此外，本研究结果显示，随访结束时两组间TC、TG、HDL-C、LDL-C变化的差异均无统计学意义；这可能与菌株和配方的使用不一致、目标人群的异质性、饮食结构，以及肠道菌群结构不完全一致有关。

本研究中的肠道菌群结果分析提示，益生菌组干预后较干预前乳杆菌属占比显著增高，而安慰剂组干预后较干预前各菌属占比的差异无统计学意义；提示，补充益生菌能一定程度地改善肠道菌群结构。本研究中未发现两组间干预后菌群的差异有统计学意义，这可能与本研究选取的粪便样本量较小、同一组内样本个体差异较大，以及饮食等其他因素影响有关。此外，在干预后，两组卡氏伯克霍尔德菌-副伯克霍尔德菌等与土壤发酵相关的菌属存在一定的差异，考虑与标本取材及保存的质量控制有一定的相关性。

本研究是首次通过在中国人群探讨益生菌干预IGT向T2DM转化，且为期较长的随机安慰剂对照研究，但本研究存在一定的局限性。首先，本研究采用的益生菌补充剂对中国受试者的研究结果，并不能代表其他菌株对其他人群或人种的影响。其次，本研究未记录受试者的生活方式，如饮食及运动情况，而生活方式可能会对血糖的转归有一定影响，但研究设计的安慰剂对照可最大程度弥补相关影响。最后，本研究纳入的样本量相对较小，使得检验两组率差异的统计效能偏低。

综上所述，予IGT患者补充双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的活性益生菌是安全的，但不能降低IGT向T2DM转化的风险。尽管如此，仍有必要探索不同益生菌菌种对IGT的效应。