卢波，王瑞春，王秋生，孟波，陈骏萍

疼痛的感觉部分和情绪部分由不同的神经传导通路传导，而且最终对其进行整合、调控和处理的大脑脑区也并不完全相同。研究表明，边缘系统中的前扣带皮层（ACC）与痛情绪的形成与维持密切相关[1-2]，目前对其具体机制尚不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）参与脊髓水平的痛觉中枢敏化和ACC脑区的痛情绪调控[3-5]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是mTOR通路的上游信号分子，通过负性调控mTOR 通路参与蛋白质的合成，进而作用于脊髓背角神经元的中枢敏化[6]。但是，关于mTOR 通路调控痛情绪的形成过程是否依赖于AMPK 的活性变化，目前尚不清楚。基于此，本研究拟观察激活ACC 脑区AMPK 对大鼠痛情绪反应以及mTOR活性的影响。报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠30只，体质量230 ～300 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心，饲养于宁波大学SPF 级实验动物中心。本研究在实施前已获得宁波大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验分组 将大鼠随机分为甲醛模型组（F组）、AMPK激动剂组（A组）和溶剂对照组（C 组），各10 只。所有大鼠均在七氟烷麻醉下建立甲醛炎性痛模型，在左侧足底皮下注射5%甲醛溶液50 l，建立模型。

1.3 方法 ACC脑区置管和药物输注大鼠麻醉后头部固定于脑立体定位仪上，门齿杆－ 3.3 mm。检测是否固定成功的标准：鼻对正中，头部不动，提尾不掉。按照大鼠脑图谱选取ACC坐标（AP：+2.6mm，L：±0.6 mm，H：－ 2.5 mm）。用牙科钻于进针点处钻一小孔，深度至硬脑膜。将外套管缓慢植入，并以牙托粉固定于颅骨表面。待牙托粉凝固后，外套管塞入长度较套管长0.2 mm 的不锈钢内芯并盖上导管盖。术后隔天插拔内芯一次，防止套管堵塞。

A 组和C 组于建模前20 min 经套管注射相应药物或溶剂。以七氟烷麻醉，将套管内芯拔出，插入注射内管，注射内管尖端长于套管0.2 mm，末端通过PE-10 软管连接微量进样器。双侧ACC给药，每侧注射0.5 l 药物或溶剂。其中，AICAR（Sigma公司，美国）用DMSO溶解，PBS稀释（DMSO终浓度为0.5%）为20 mol/L，溶剂对照为0.5% DMSO。在3 min 内注射完毕，随后留针5 min，防止液体溢出，使药液充分扩散。

1.4 甲醛条件位置回避训练（F-CPA）CPA 训练箱由3 个小室组成，其中A、B室等大并排放置，C室位于A、B室前方。A室壁为黑白相间的垂直条带，以1%醋酸溶液作为气味剂；B 室壁为黑白相间的水平条带，以1%桂皮水作为气味剂；C 室内壁灰色，无标记，无气味。

第1 天，将大鼠放入C室，待其进入A 或B 室后，关闭C 室与A、B 室间的小门，记录15 min 内动物在A、B 室的停留时间。第2 ～3 天，大鼠不经任何处理直接放入甲醛非条件匹配室，任其在内自由活动45 min。间隔4 h 后，大鼠左侧足底注射甲醛或0.9%氯化钠注射液后放入甲醛条件匹配室（A 或B 室，信封法随机选择），同样使其在内45 min 后取出。第4 天，操作过程同第1 天，记录大鼠15 min 内在A 和B 室所停留的时间。计算回避分数（训练前后在甲醛条件室停留的时间差值）以评价大鼠是否形成条件性位置回避，回避分数越高提示痛情绪越显著。

1.5 免疫印迹 CPA行为学结束后，大鼠被过量的七氟烷麻醉处死，取ACC（AP 3.7 ～0.7 mm）。加入裂解液并破碎组织，4 ℃离心30 min，取适量上清液用BCA 试剂盒测蛋白浓度。剩余上清液取适量，按上清液：5×Loading buffer为4：1 的量加入5×Loading buffer。放入99.9 ℃水浴煮沸5 ～10 min，之后将样品分装―80℃条件保存。

根据蛋白浓度确定上样量。电压设定60 V 待条带压成一条线后调整为80 V 跑胶，结束后用100 V，90 min 转膜。转膜前需先用甲醇活化PVDF 膜。转膜后加入5 ml 封闭液室温封闭1 h。封闭后加兔来源的抗磷酸化mtor（Ser2448，cat no.2971，1∶500，CST 公司）和小鼠来源抗-actin抗体（1∶2 000，Santa cruz公司）4 ℃摇床孵育过夜。用1×TBST 清洗之后加二抗室温避光孵育1 h 后，红外荧光扫描仪曝光。使用ImageJ 软件（NIH，Bethesda，MD USA）对Western blot 结果的灰度图像进行半定量分析。

1.6 统计方法 数据采用GraphpadPrism7.0 统计软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验，多重比较采用Bonferroni检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痛情绪比较 与CPA 训练之前相比，F 组和C 组大鼠训练后在条件室内停留时间明显减少（t=4.34、6.63，均P＜0.01）。A 组大鼠训练前后在条件室内停留时间差异无统计学意义（t=1.34，P＞0.05）。3 组大鼠回避分数差异有统计学意义（F=3.68，P ＜0.05），其中A 组回避分数显著低于C 组和F 组（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。见封四彩图5 ～6。

2.2 ACC中mTOR磷酸化形式（p-mTOR）的表达 3 组大鼠ACC 中p-mTOR 表达差异有统计学意义（F=8.67，P ＜0.01），其中A组显著低于F组和C组（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。见封四彩图7。

3 讨论

外周疼痛刺激信息经脊髓背角投射至高位中枢后，大脑的不同脑区以相互分工、相互联系的方式整合、处理和调控疼痛感觉和疼痛情绪信息，其中ACC主要负责处理疼痛相关的负性情绪信息，并促进疼痛相关情感、认知和反应的抉择[1-2,7]。然而，目前对其具体的细胞和分子机制了解较少。笔者前期研究表明，慢性疼痛（甲醛疼痛刺激）可诱导ACC内p-mTOR、p-p70S6K表达的显著上调，预先给予雷帕霉素可阻断痛情绪行为的产生[5]。在此基础上，本研究进一步发现，激活AMPK 同样能够削弱甲醛诱导的痛情绪，并且其机制可能与AMPK 负性调控mTOR 磷酸化表达降低有关。

研究显示，AMPK 通过对mTOR 信号通路的负性调控，参与了痛觉中枢敏化的形成[8-10]。脊神经结扎的动物模型上，脊髓背角p-AMPK 的表达显著减少[10]；AMPK 激动剂可抑制mTOR 的活性和下游翻译元件的表达，抑制蛋白翻译，进而减轻外周神经损伤或手术切口引起的触诱发痛；并且，AMPK激动剂可显著降低离体背根神经节神经元的兴奋性[8-9]。这些研究证据提示了AMPK/mTOR 通路在慢性疼痛中发挥着重要作用。本研究结果初步提示了ACC 脑区中AMPK通过调控其下游mTOR通路参与痛情绪的形成和发展，但是仍有诸多问题尚需进一步研究，如：（1）慢性疼痛的经典分子ERK 同样受AMPK 的调控[9]，那么ERK通路与mTOR通路是否存在关联？（2）AMPK 目前有多种激动剂，如AICAR、二甲双胍等[11]，不同的激动剂是否产生同样的镇痛效果？（3）F-CPA 将疼痛与情绪分开，目的是为了在研究痛情绪时不受痛感觉的干扰，然而近年来痛与负性情绪（如抑郁）共患也是疼痛研究热点，AMPK-mTOR 通路在不同痛情绪模型中的作用也值得研究者进行探讨。

综上所述，激活ACC脑区AMPK能够削弱甲醛炎性痛诱导的痛情绪，其机制与AMPK 调控mTOR 活性的变化有关。