杨慧芬 毛娟娟

1.浙江省杭州市中医院乳腺科，浙江杭州 310007；2.浙江省宁波市中医院外二科，浙江宁波 315012

乳腺癌全球新发病例已超肺癌位居首位，严重危害女性身心健康[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2 均呈阴性的乳腺癌，生存率低，恶性程度高，易复发转移，且无理想治疗靶点[2]。顺铂（Cisplatin，CDDP）是治疗TNBC 的有效手段之一，但易产生耐药性影响化疗效果[3]。因此逆转CDDP 的耐药性对治疗TNBC 具有重要意义。

缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可介导肿瘤细胞适应缺氧微环境，并参与肿瘤细胞的耐药形成[4-5]。二至丸合桂枝汤可降低MDAMB-231 细胞中HIF-1α 蛋白表达，并抑制细胞生长。由此，二至丸合桂枝汤可能通过调控细胞HIF-1α 的表达参与TNBC 细胞CDDP 耐受机制。首先制备CDDP 耐药细胞株（MDA-MB-231/CDDP），并给予二至丸合桂枝汤和CDDP 干预，探讨二至丸合桂枝汤对MDA-MB-231/CDDP 细胞株的CDDP 的耐受及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20 只SPF 级SD 大鼠，体重（200±30）g，购于上海斯莱克动物实验有限公司[SCXK（沪）2017-0015]，在标准环境下[温度（23±2）℃，湿度为55%～70%，12 h光/暗循环]饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心[（浙）2020-0024）]，自由饮食饮水。所有动物实验均参照实验动物保护和使用的指南[6]，并经杭州鹰旸生物科技有限公司伦理委员会批准。

1.2 实验材料与仪器

人乳腺癌细胞MDA-MB-231（货号：iCell-h133）购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。二至丸合桂枝汤方剂（炙甘草6 g，桂枝、芍药、生姜各9 g，女贞子、旱莲草各10 g，大枣12 枚，水煎，浓缩至1 g/ml，置于4℃冰箱保存备用）。HIF-1α（1∶500，AF1009）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（1∶500，AF5131）、GAPDH（1∶3000，AF7021）抗体购于Affinity。CCK8 试剂盒（货号：HY-K0301）购于MCE；MTT 试剂盒（货号：E606334-0500）购于BBI Life Sciences；细胞凋亡试剂盒（货号：556547）购于BD。LightCycler®96实时荧光定量PCR仪购于Roche罗氏；Nanodrop one mRNA 定量仪购于Thermo Scientific；Mastercycler 普通PCR 仪购于Eppendorf。

1.3 耐药细胞株的建立及细胞活力检测

采用药物连续诱导法筛选耐药细胞。取对数生长期MDA-MB-231 细胞接种于含CDDP 及10%胎牛血清的DMEM 培养液中，CDDP 浓度为0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 逐步诱导，作用48 h 后换新培养液，每2～3 天传代1 次，历时6 个月[7]。

MDA-MB-231/CDDP、MDA-MB-231 细 胞（2×104/ml，100 μl/孔）接种于96 孔板，加终浓度为0.01、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L 的CDDP，同时以未加入CDDP 的样孔作为对照组，培养48 h 后，加入10 μl/孔CCK-8 试剂，混匀，在5% CO2、37℃培养箱内孵育。用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，计算细胞活性，各平行测定6 个复孔。

1.4 含二至丸合桂枝汤血清制备

20 只健康大鼠按随机数字表法分为对照组和二至丸合桂枝汤给药组，每组10 只，具体分组方法为，将大鼠依次编为1～20 号，然后任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录20 个数，令单数代表对照组，双数代表二至丸合桂枝汤给药组。对照组给予蒸馏水，其余大鼠给予8.5 g/（kg·d）二至丸合桂枝汤，连续灌胃给药7 d 后，经腹主动脉收集5 ml 血标本静置后离心，同组上清液合并，灭活过滤-80℃冰箱保存。

1.5 给药分组及细胞活力检测

将MDA-MB-231/CDDP 细胞株随机分为以下四组：空白组（不做任何处理）、二至丸合桂枝汤组（200 μg/ml 二至丸合桂枝汤）、CDDP 组（10 μmol/L CDDP）、联合组（200 μg/ml 二至丸合桂枝汤+10 μmol/L CDDP）。各组细胞置于DMEM 高糖培养基、5% CO2、37℃恒湿孵箱环境中培养24、48 h 后，用CCK-8 试剂检测24、48 h 的细胞活力，各组平行测定6 个复孔。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组对数生长期细胞（1.2×106个细胞/孔）接种于6 孔板。处理48 h 后，洗涤，调整为1×106个/ml。用结合缓冲液洗涤后重悬于100 μl 结合缓冲液，与5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI 室温避光反应15 min。加入400 μl 结合缓冲液1 h 内检测。实验重复3 次。

1.7 定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptasemediated PCR，qRT-PCR）

利用qRT-PCR 检测不同剂量CDDP 对MDAMB-231细胞、MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表达情况及上述“1.5”分组中VEGF、HIF-1α mRNA 表达情况。提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，特异性扩增VEGF、HIF-1α，GAPDH 为内参，反应条件为95℃，10 min 变性；95℃，15 s；60℃，60 s；40次循环。采用2-△△Ct方法计算VEGF、HIF-1α mRNA 表达量。HIF-1α：正向引物：5’-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3’，反向引物：5’-CTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’；VEGF：正向引物：5’-CAGCGCAGCTACTGCCATC-CAATCGAGA-3’，反向引物：5’-GCTTGTCACATCTGCAATGCAAGTACGTTCGTTTA-3’；GAPDH：正向引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物：5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。

1.8 Western blot

利用Western blot 检测不同剂量CDDP 对MDAMB-231细胞、MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1α 蛋白表达情况及上述“1.5”分组中VEGF、HIF-1α 蛋白表达情况。RIPA 提取蛋白，BCA 试剂盒测定总蛋白浓度。经SDS-PAGE 分离后转至PVDF膜，TBST 洗膜。行免疫印迹，封闭后，加一抗稀释液（VEGF、HIF-1α），4℃孵育过夜，加入二抗[IgG H&L（HRP），稀释倍数为1∶3000]，室温反应1～2 h。以GAPDH 为内参。化学发光仪显影。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐者采用SNK-q 检验，方差不齐者，组间两两比较采用Kruskal-Wallis H 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDDP 对两种细胞活性的影响

CDDP 浓度分别为0.1 μmol/L 和0.5 μmol/L 时，MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP 细胞活性均低于相应对照组（不用CDDP 处理）的细胞活力，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。且MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP 细胞对CDDP 的IC50值分别为1.6001 μmol/L和36.4320 μmol/L。见图1。

图1 不同剂量CDDP 对MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP 细胞活性的影响

2.2 CDDP 对两种细胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表达的影响

CDDP 浓度为0.1 μmol/L 的MDA-MB-231 细胞中HIF-1α mRNA 表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），CDDP 浓度为0.5、1、5、10 μmol/L 的MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。CDDP 浓度为10 μmol/L时，MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF mRNA 表达水平高于MDA-MB-231 细胞，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 不同剂量CDDP 对MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF、HIF-1α mRNA 表达情况的影响

2.3 CDDP 对两种细胞中HIF-1α、VEGF 蛋白表达的影响

CDDP 浓度为1、5、10 μmol/L 的MDA-MB-231细胞中HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），MDA-MB-231/CDDP 细胞HIF-1α 蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；MDA-MB-231/CDDP 细胞各组间VEGF 蛋白表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。当CDDP 浓度为5、10 μmol/L 时，MDA-MB-231/CDDP 细胞中HIF-1α蛋白表达水平高于MDA-MB-231 细胞，差异有统计学意义（P ＜0.05）。当CDDP 浓度为1、10 μmol/L 时，MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF 蛋白表达水平高于MDA-MB-231 细胞，差异有统计学意义（P ＜0.05）。因此，选择10 μmol/L CDDP 进行后续实验。见图3。

图3 不同剂量CDDP 对MDA-MB-231、MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF、HIF-1α 蛋白表达情况的影响

2.4 二至丸合桂枝汤联合CDDP 抑制MDA-MB-231/CDDP 细胞活性

作用24 h 后，二至丸合桂枝汤组细胞存活率与空白组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。CDDP 组和联合组细胞存活率均低于空白组，联合组细胞存活率低于CDDP 组和二至丸合桂枝汤组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。作用48 h 后，二至丸合桂枝汤组、CDDP 组和联合组细胞存活率均低于空白组，联合组细胞存活率低于CDDP 组和二至丸合桂枝汤组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图4。

图4 各组MDA-MB-231/CDDP 细胞活性变化情况

2.5 二至丸合桂枝汤联合CDDP 促进MDA-MB-231/CDDP 细胞凋亡

二至丸合桂枝汤组、CDDP 组和联合组细胞凋亡率均高于空白组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），其中，联合组细胞凋亡率高于二至丸合桂枝汤组及CDDP 组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图5。

图5 各组MDA-MB-231/CDDP 细胞凋亡情况

2.6 二至丸合桂枝汤调控HIF-1α 信号通路逆转MDA-MB-231/CDDP 细胞的CDDP 耐药性

CDDP 组和联合组MDA-MB-231/CDDP 细胞中HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表达水平均低于空白组，联合组低于二至丸合桂枝汤组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图6。

图6 各组MDA-MB-231/CDDP 细胞中VEGF、HIF-1α 表达情况

3 讨论

CDDP 是治疗TNBC 常用化疗药物之一，与双功能烷化剂类似，可与DNA 共价结合，生成Pt-DNA，阻滞细胞周期，抑制DNA 复制和转录，进而诱导细胞凋亡[8]。然而胞内CDDP 积累降低、肿瘤微环境变化、DNA 损伤修复增加或凋亡信号通路改变等导致耐药性产生，限制了其疗效[9-11]。故逆转CDDP 耐药性对治疗TNBC 有重要意义。近年来，中药在逆转CDDP 耐药性方面中具有独特的优势[12]。

HIF-1α 与肿瘤细胞耐药形成密切相关[5]，可通过激活MDR-1 基因，上调耐药蛋白P 糖蛋白表达，将药物泵出细胞膜外。同时调控癌细胞的增殖与存活，拮抗B 细胞淋巴瘤2 家族蛋白等抗凋亡因子表达，引起自噬；此外，还可抑制DNA 损伤，调控代谢重组等[13-14]。VEGF 是HIF-1α 下游靶基因，在肿瘤新生血管生成过程中具有重要作用。肿瘤细胞缺氧时，可激活HIF-1α，诱导VEGF 转录和表达，结合特异性受体，调控血管内皮的迁移与增殖，并改变管壁的结构，介导肿瘤细胞适应缺氧微环境[15-16]。此外，PI3K/AKT/HIF-1α信号通路可逆转5-氟尿嘧啶耐药性，抑制糖酵解，增强抗肿瘤活性[17]；抑制HIF-1α 表达可介导肝癌细胞对Sorafenib 的耐药性[18-19]。本研究制备的MDAMB-231/CDDP 细胞株对CDDP 敏感性降低，在待定的CDDP 浓度干预下，对VEGF、HIF-1α mRNA 及蛋白表达水平高于MDA-MB-231 细胞。

二至丸合桂枝汤可有效改善绝经前Luminal 型乳腺癌患者的生殖激素水平，对TNBC 也具有良好的疗效[20-23]。现代药理研究表明，二至丸合桂枝汤中的芍药苷具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗抑郁、免疫调节等药理作用[24]；女贞子具有抗肿瘤活性，并参与细胞凋亡[25]。联合组可显著抑制耐药肿瘤细胞活性。并降低HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表达水平。提示二至丸合桂枝汤可抑制HIF-1α 信号通路，下调VEGF 表达，从而逆转MDA-MB-231/CDDP 细胞的CDDP 耐药性。

细胞凋亡是化疗杀伤肿瘤细胞的共同路径，也是肿瘤细胞耐药的作用机制之一[26]。低氧状态下，HIF-1α对细胞凋亡的影响与缺氧程度、原癌基因转录条件有关[27]。本研究中，二至丸合桂枝汤可促进CDDP 诱导的MDA-MB-231/CDDP 细胞凋亡，可能是由于二至丸合桂枝汤促进CDDP 激活的HIF-1α 上调BNIP3表达，抑制抗凋亡蛋白，诱导MDA-MB-231/CDDP 细胞凋亡[28]。

因此，二至丸合桂枝汤可通过调控HIF-1α 信号通路，下调VEGF 表达，逆转TNBC 细胞系的CDDP耐药性。