万亚琴 王小琴

1.湖北中医药大学中医临床医学院，湖北武汉 430061；2.湖北省中医院肾内科，湖北武汉 430061

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是常见的微血管并发症，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）死亡主要原因，也是终末期肾脏疾病（end-stage renal disease，ESRD）最常见病因[1]。由于发病机制复杂，西医在临床上尚缺乏有效治疗手段，而湖北省中医院研制的肾元颗粒由黄芪、大黄、淫羊藿三味药组成，针对DN“脾肾亏虚，浊毒内盛”病机，以“温补脾肾、通腑泄浊”立法所创，在DN 治疗中已取得了一定疗效。

但由于缺乏有效研究方法，肾元颗粒分子机制难以阐明。网络药理学[2]是一门新兴交叉学科，是综合药学和计算机等学科构建药物作用靶点与疾病关系网络，分析药物作用机制的科学，目前在中药配方研究中应用日益增多。基于此，本研究拟通过网络药理学方法，深入发掘肾元颗粒治疗DN 的作用机制，为临床肾元颗粒的广泛应用打下理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据库和软件

检索药物成分和靶点数据库：中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）；检索疾病靶点：GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank 等数据库；构建蛋白互作网：STRING；绘制网络图：Cytoscape 3.7.2；下载与人类基因靶点名称：Uniprot；Venn软件绘制维恩图；R语言及Bioconductor软件作GO 生物学和KEGG 代谢通路富集分析。

1.2 肾元颗粒成分及预测靶点获取

TCMSP 数据库[3]是一款分析中药有效成分、药物与疾病作用靶点的综合数据库。利用TCMSP 数据库找出黄芪、大黄、淫羊藿所有化学成分，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug likeness，DL），对收集的化合物成分和靶点进行整理。在Uniprot数据库下载注释文件，对靶点进一步修正和转换。

1.3 DN 疾病靶点基因检索

GeneCards 是人类基因简编，导航与关联人类基因、疾病、蛋白质、细胞和生物途径的数据库；OMIM是基因和遗传表型的存储库；PharmGKB 网站可提供各种药理学领域信息，是从原始文献注释到基于遗传信息调整药物治疗的指南；TTD 是疾病靶点调节的RNA 及目标蛋白数据库；DrugBank 是疾病及靶点信息数据库。本研究将“diabetic nephropathy”“diabetic kidney disease”作为关键词，挖掘上述五大数据库，检索DN 基因并取交集。

1.4 肾元颗粒治疗DN 交集靶点基因筛选

运用R 语言联合Venn 软件，绘制肾元颗粒治疗DN 交集靶点维恩图，获得两者交集靶点基因。

1.5 肾元颗粒成分-交集靶点-疾病网络的构建

采用Cytoscape 3.7.2 软件将化合物成分及交集靶点导入，进行肾元颗粒成分-交集靶点-疾病网络的构建。

1.6 蛋白互作网络的构建及关键靶点筛选

运用STRING 在线数据库（string-db.org）处理上传的交集靶点蛋白，构建出蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络图，图形以png格式输出。

将节点信息导入Cytoscape 3.7.2 中，绘制PPI 网络，采用CytoNCA 拓扑属性构建关键靶点蛋白拓扑图。根据节点度值（degree）、中介中心度值（betweenness centrality，BC）对化合物成分和关键靶点筛选排序。

1.7 GO 生物学过程和KEGG 代谢通路富集分析

利用R 语言和Bioconductor 包，对关键靶点基因进行GO 生物功能富集分析和KEGG 代谢通路富集分析。

2 结果

2.1 肾元颗粒成分-预测靶点图构建

运用TCMSP 数据库，严格按照OB ≥30%和DL≥0.18 为筛查条件，收集到35 种药物成分及相应预测靶点292 个，主要成分为槲皮素、7-O-甲基异丁香酚、山柰酚等。

2.2 肾元颗粒治疗DN 交集靶点

检索GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank五大数据库，删除重复项、没有靶点成分及合并后，最终获得439 个疾病靶点。疾病靶点与药物预测靶点取交集，最终交集靶点获得67 个。见图1。

图1 肾元颗粒治疗DN 交集靶点维恩图

2.3 肾元颗粒成分-交集靶点-疾病网络

采用Cytoscape 3.7.2 软件将化合物成分及交集靶点导入，进行网络构建，共有188 个节点，477 条边。见图2。

图2 肾元颗粒成分-交集靶点-疾病网络图

2.4 PPI 网络构建及关键靶点筛选

将交集蛋白上传至在线STRING 数据库，获得PPI网络，设置置信度为0.9，剔除离散靶点，获得55 个交集蛋白，采用CytoNCA 拓扑属性构建关键靶点蛋白拓扑图。见图3～4。

图3 肾元颗粒防治DN 交集蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

根据节点degree 和BC 值对化合物成分及交集靶点基因排序，前3 位化合物成分为槲皮素、7-O-甲基异丁香酚、山柰酚；关键靶点为蛋白激酶B、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）。

2.5 GO 生物学过程和KEGG 代谢通路富集分析

2.5.1 GO 富集分析 GO 富集分析显示，生物学过程主要涉及G 蛋白偶联受体信号通路过程、调节血管直径等过程；细胞成分主要涉及突触前膜、后膜等；分子功能主要涉及G 蛋白偶联胺受体、G 蛋白偶联神经递质受体等。见图5（封三）。

图4 肾元颗粒“交集蛋白-关键靶点”拓扑图

图5 关键靶点GO 生物学过程富集分析

2.5.2 KEGG 代谢通路富集分析 KEGG 代谢通路富集分析显示，关键靶点涉及到刺激神经组织通路、PI3KAkt 通路、MAPK 通路等，肾元颗粒可通过多通路协调作用治疗DN。见图6（封四）。

图6 关键靶点KEGG代谢通路富集分析

3 讨论

DN 是DM 最严重并发症，以肾小球肥大、基底膜增厚、细胞外基质积聚为特征，最终导致ESRD，影响患者生活及生存质量。近年来，本课题组在肾元颗粒治疗DN 实验室研究方面[3-10]已取得一定进展，但其具体疗效机制仍不清楚。

本研究显示肾元颗粒治疗DN 主要成分是槲皮素、7-O-甲基异丁香酚、山柰酚等，关键靶点是蛋白激酶B、VEGFA 和EGFR 等。山柰酚[11-12]源于姜科植物山柰的根和茎，具有抗炎、抗氧化应激和改善DN 大鼠肾功能作用。槲皮素可发挥抗炎、抗氧化作用，促进DM 性伤口愈合，增强裂孔膜蛋白表达，改善足细胞损伤，减少蛋白尿，发挥抗DN 功能[13-14]。

蛋白激酶B[15-16]又称AKT1，可抑制胰岛素受体去磷酸化，调节葡萄糖转运和储存，参与机体炎症反应，是细胞增殖和凋亡关键蛋白。VEGFA[17]是促血管生成关键细胞因子，在正常肾小球足细胞中高表达，维持肾小球内皮细胞基本信号，高糖诱导VEGFA 过度表达，肾小球基底膜通透性升高、进行性蛋白尿加重；研究表明[18]，山柰酚导致EGFR/P38 信号通路激活、P21表达上调，抑制肾脏癌细胞生长。

GO 生物学过程和KEGG 代谢通路富集分析表明：GPCR 信号通路是药物靶点作用的重要通路[19]，与DN 有关GPCR 包括5-羟色胺2A 受体、血管紧张素Ⅱ受体等；PI3K-Akt 信号通路[20-21]是胰岛素调控肝糖原生成的关键通路，胰岛素抵抗及DM 发病都与该通路有关。研究证实[22]，PI3K-Akt 通路抑制，功能下调会导致DM 大鼠肾小管凋亡，而其通过调控肾组织中水通道蛋白-1 表达能改善DN 症状。MAPK 通路[23-25]作为细胞因子信号转导中转站，参与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡过程。研究表明，抑制此通路可减轻巨噬细胞浸润和炎症介质释放，减少蛋白尿，延缓DN进程。综上，本研究预测结果与目前已知文献报道基本吻合[26]，提示网络药理学筛选及预测具有一定科学性。

肾元颗粒以黄芪为君，温补脾肾、利水消肿；淫羊藿为臣，补肾壮阳，专补命门之火；酒制大黄为佐使，味苦性寒，化瘀解毒、通腑泄浊。全方温补脾肾，使脾司散精，肾司开阖；通腑泄浊使水湿、瘀血、浊毒等实邪排出体外，共奏温补脾肾、通腑泄浊之力。

结合中医理论综合考量发现，本研究仍存在不足之处：①由于中西医“肾”概念差异，肾元颗粒治疗DN在药物成分和靶点选择方面可能存在区别；②中西医划分疾病阶段标准差异，影响疗效观察。后续本课题将结合上述结果和前期研究数据，进行分子机制研究及临床验证。

综上，本研究以网络药理学为基础，探讨了肾元颗粒治疗DN 效果机制，阐明了中医药多通路、多靶点综合干预可行性与治疗特色，为后续临床和实验设计等提供一定理论依据。