王 伟， 张翠云， 李金英， 宫月娇， 康晓静

(秦皇岛市工人医院1.妇产科，2.内科, 3.超声科，河北省秦皇岛市 066200)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种复杂异质性的内分泌疾病，占生育年龄妇女的5%～10%，其特征是慢性无排卵、多囊卵巢和高雄激素血症[1-3]。PCOS的病因尚不明确，其发病机制可能是环境因素与遗传因素相互作用的结果。根据以往的研究，miRNAs参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢等过程[4-5]。因此，miRNAs在控制生殖内分泌中可能起重要作用，尤其是在卵泡形成和卵母细胞成熟过程中起作用[6]。miR-146a位于人的第5号染色体上，在人体分泌代谢中发挥核心作用[7]。相对健康女性，PCOS患者中miR-146a的表达水平显著增加[8]。Pre-miRNA的某些多态性会影响成熟miRNA的表达或生物学功能发生变化，显示miR-146a-5p基因多态性与多种肿瘤的进展关系密切[9]。miR-146a在PCOS患者的血浆、卵泡液和颗粒细胞中被上调[10]，提示miR-146a与PCOS存在一定关系，鉴定其基因多态性有助于阐明疾病的发病机制。本研究旨在探讨miR-146a-5p基因多态性与PCOS发病风险的关系，以期为PCOS患者临床治疗提供遗传学依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2018年6月—2019年12月本院妇科确诊为多囊卵巢综合征患者122例作为观察组，年龄22～39岁，平均(27.9±4.7)岁。PCOS的诊断采用2003年鹿特丹诊断标准：①稀发排卵或无排卵；②高雄激素的临床表现和(或)高雄激素血症；③PCO超声提示：一侧或双侧卵巢直径2～9 mm的卵泡≥12个，和(或)卵巢体积≥10 mL。符合以上2条即可诊断为PCOS，排除其他高雄多囊卵巢综合征疾病如先天性肾上腺皮质增生、分泌雄激素的肿瘤、柯兴氏综合征等。选取同期本院体检正常者110例作为对照组，年龄20～38岁，平均(28.5±4.8)岁。对照组纳入标准：正常月经周期；内分泌值正常；经阴超检查正常周期显示子宫和卵巢无器质性病变，且卵巢无多囊样表现；近3个月内未用过激素类药物病史；排除标准：内分泌异常、高血压、糖尿病；有糖尿病家族史。两组研究对象在年龄、身高比较差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。

1.2 基因组DNA提取

研究对象提供外周静脉血标本后，即刻置于真空抗凝釆血管内，颠倒混匀防止凝血。采用EDTA抗凝处理，提取血液基因组DNA，血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 多态性检测

从生物信息学数据库中选择候选基因位点rs2910164，引物和探针由上海生工生物科技有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-TCTACCATACACATCCCCTACA-3′，下游引物：5′-CACACTCCTTATACCTTACGAGC-3′。探针序列：G allele：5′-GTTGTGTCAGTGTCAGACGTC-3′，C allele：5′-CCAGCTGAA GAACTGAATTTGAC-3′。PCR反应体系为20 μL，包括5 μL 10×buffer，8 μL ddH2O，50 mg/L的DNA模板2.0 μL，2 mmol/L脱氧三磷酸核糖核苷(d NTP)2.5 μL，引物(1×10-5mol/L)各1.0 μL和0.5 μL rTaq酶。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃30 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，终止72 ℃ 10 min。对PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，分析基因型。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0软件处理数据，计量资料采用独立样本独立t检验。各组间基因型频率和等位基因频率分布差异均采用χ2检验。P<0.05表示差异基因型有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组基本临床资料比较

观察组体质量、BMI高于对照组(P<0.05)；两组年龄、身高差异无显著性(P>0.05；表1)。

表1 两组基本临床资料比较

2.2 两组miR-146a-5p基因型分布

观察组和对照组miR-146a-5p的基因型分布差异有显著性(P<0.05)；miR-146a-5p的基因型在两组间的分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性(均P>0.05；表2)。

表2 两组miR-146a-5p基因型分布 单位：例(%)

2.3 miR-146a-5p多态性与多囊卵巢综合征发病风险之间的关系

观察组和对照组之间的CG基因型分布存在差异(OR=2.16，95%CI为1.19～3.70，P=0.004)。观察组中的C等位基因频率显著高于对照组(OR=1.78，95%CI为1.15～2.36，P=0.001)。CC+CG基因型显著增加了PCOS的风险(OR=1.91，95%CI为1.42～2.75，P=0.001)。对年龄和BMI进行调整后，共显性、显性和隐性模型的基因型在OR中均未显示任何显著变化(表3)。

表3 两组miR-146a-5p基因型的频率分布

2.4 PCOS影响因素的Logistic回归分析

以PCOS的发生风险为因变量，以体质量、BMI和miR-146a-5p基因型为自变量，进行Logistic回归分析，miR-146a-5p rs2910164、体质量、BMI是PCOS的独立危险因素(P<0.05；表4)。

表4 PCOS影响因素的Logistic回归分析

3 讨 论

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)在人类基因组中的发生核苷酸多态性频率比较高，大约每1 000个碱基中就有一个多态位点[11]。编码区中的SNP可能导致同义和非同义变化，非同义变化则会导致氨基酸变化或引入终止密码子，从而可导致人类疾病，据研究预测，至少25%的非同义SNP会对蛋白质功能产生负面影响[12]。研究表明，Fetuin-A基因rs1071592多态位点与PCOS遗传易感性存在相关性[13]。研究发现，血管内皮生长因子的rs2010963位点G/C多态性与多囊卵巢发病风险综合征的发病风险显著相关，携带C等核苷酸位基因(GC+CC)的妇女多囊卵巢综合征患PCOS风险比GG基因多态性型较低[14]。在PCOS疾病的发生过程中可能会有一些miRNAs表达改变，在一定程度上会影响患者卵母细胞质量，可能造成不良助孕等影响[15]。rs2910164位于miR-146a前体(Pre-miR-146a)多态性序列上，碱基G/C的多态性突变可能导致miR-146a前体的茎结构从G∶U不匹配变为C∶U不匹配，可能影响成熟miR-146a的表达及对靶基因的调控功能[16]。miR-146a的rs2910164位点主要研究多态性与多种疾病的关系，miR-146a rs2910164 C等位多态性核苷酸基因可干扰pre-miR-146a与转录核因子的结合DNA，减少pre-miR-146a和核苷酸成熟miR-146a的表达量[17]。

研究表明，肥胖为PCOS发病的独立危险因素[18]。miR-146a-5p可参与脂肪形成过程胰岛素信号传导途径，通过作用多肽蛋白与胰岛素受体转氨酶在脂肪形成的过多态性基因程发挥重要作用[18]。本研究发现，两组miR-146a-5p基因rs2910164位点均有CC、CG和GG三种基因型，等位基因频率在两组间的分布符合Hardy-Weinberg平衡。miR-146a-5p的rs2910164位点突变与PCOS密切相关。研究结果表明，miR-146a-5p rs2910164、体质量、BMI是PCOS的独立危险因素。提示检测miR-146a-5p中的rs2910164位点的多态性可以评估妇女PCOS发病风险。

综上所述，miR-146a-5p的rs2910164位点C等位基因与PCOS发病风险增加有关，可以作为预测PCOS发病风险的潜在生物标志物。