张 蓉， 张晓艳

(1.北京市宣武中医医院检验科, 北京市100050；2.军事医学科学院，北京市100850)

糖尿病是一种异质性的代谢紊乱疾病，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)以胰岛素抵抗为特征，肥胖是导致胰岛素抵抗的常见病因，脂肪组织通过分泌调节促炎性脂肪因子，在肥胖相关的胰岛素抵抗的发病机制中起主要作用[1-2]。瘦素主要由白色脂肪组织中的成熟脂肪细胞产生，参与多种内分泌和生理过程。

糖尿病与肥胖基因6号染色体上的瘦素编码基因Lepob上的一个常染色体隐性突变有关，密码子105的无义突变C到T将精氨酸残基改变为终止密码子，导致过早截断，使翻译的蛋白质失去生物学活性[3]。因此，尽管脂肪细胞中有高水平的瘦素mRNA，但动物完全缺乏功能性瘦素，由此成为研究肥胖相关的T2DM常见小鼠模型。

本研究利用二代测序(next-generation sequencing, NGS)[4]对B6.V-Lepob/J和C57BL/6进行转录组测序，研究瘦素缺陷T2DM小鼠与普通小鼠转录组基因差异，寻找在肥胖型T2DM小鼠中的关键基因，对预防、诊断和治疗肥胖型T2DM患者有着重要意义。

1 资料和方法

1.1 动物处理

雄性8周龄ob/ob小鼠5只，雌性8周龄ob/ob小鼠4只，雄性8周龄C57BL/6J小鼠5只，雌性8周龄C57BL/6J小鼠4只(均购自南京大学模式动物所，4%脂肪的SPF级小鼠饲料和玉米芯垫料均购自北京维通利华)，小鼠被安置在(22±2) ℃的环境中，按照固定的12 h光/暗周期进行饲养，饲养2周后进行实验。2周后，用1.2 g/kg乌拉坦和50 mg/kg α-氯醛糖混合液腹腔麻醉小鼠，处死小鼠后，取小鼠胰腺组织置入液氮和4%甲醛溶液，以便于提取RNA及观察两组小鼠胰腺组织病理变化。

1.2 RNA提取

在加入液氮的研钵中，将胰腺组织剪成小块、磨成粉末，取50 mg加入EP管(盛有1 mL的Trizol液)，混匀。室温放置5 min，加入氯仿200 μL，盖紧EP管，剧烈摇荡15 s。12 000 r/min离心10 min，取上层水相置于另一EP管，加入异丙醇500 μL，温和混匀。室温放置10 min，12 000 r/min离心10 min。弃去上清，加入75%乙醇1 mL，涡旋混匀，4 ℃下12 000 r/min离心5 min。重复操作1次。弃去上清，室温或真空干燥5～10 min。DEPC水将RNA溶解，必要时温水浴10 min。吸取上清到离心管，加入氯仿(1/5体积)混匀，放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；重复操作1次。吸取上清到离心管中，加入无水乙醇1.5倍体积，混匀。上述溶液转移至吸附柱，8 000 r/min离心1 min，倒掉废液，放回收集管。350 μL RWT加入吸附柱中，8 000 r/min离心1 min，倒掉废液，然后将其放回收集管中。DNaseI 80 μL加入吸附柱中，25℃消化DNA 15 min，轻柔混合；350 μL RWT加入吸附柱中，8 000 r/min离心1 min，倒掉废液，然后将其放回收集管中。RPE洗涤液500 μL洗涤1次，8 000 r/min离心1 min。弃掉收集管废液，然后12 000 r/min离心2 min。把吸附柱移到收集管，加入预热50 ℃过的15～20 μL RNase-free Water，室温放2 min，12 000 r/min离心2 min，得RNA溶液。

1.3 转录组分析

利用mRNA带有polyA尾的结构特征，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，按照NEB普通建库方式进行建库。库检合格后，把文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。随后过滤掉测序获得原始数据中少量带有测序接头或测序质量较低的数据(接头的，含无法确定碱基信息的和质量较低的)，进行测序错误率检查和GC含量分布检查，可获得后续分析使用的数据。之后使用HISAT2软件将质控后的数据比对到C57小鼠参考基因组上(mm10, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/mus_musculus/dna/)。最后，对每个样本分别进行基因表达水平的定量分析，再合并得到所有样本的表达矩阵。

1.4 差异基因分析

由于测序深度和基因长度的影响，计算各样本所有基因的表达值后，利用盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况。之后，使用R软件的edgeR[5]对样本的转录组数据的测序深度进行校正，然后进行假设检验概率(P)的计算，最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。筛选条件logFC≥2或logFC≤-2，P<0.05则认为具有统计学意义。

1.5 差异基因的生物学功能及信号通路分析

本研究利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[6]在线数据库对差异基因进行基因本体论(gene onotology，GO)和京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析，条件是P<0.05。

1.6 蛋白质-蛋白质互相作用(protein-protein interaction, PPI)构建及Hub基因筛选

使用STRING数据库(https://string-db.org/)[7]预测PPI网络，分析蛋白质之间的功能性相互作用有助于阐明疾病的产生、发展机制。利用STRING数据库构建差异基因的PPI网络，使用Cytoscape的插件cytohubba[8]和MCODE[9]构建拓扑聚类密集连接区域的中枢基因(hubgene, Hub)。

1.7 中枢基因表达量及相关性分析

利用R软件corrplot包和vioplot包进行相关性和表达可视化，展示中枢基因在ob/ob小鼠和C57BL/6J差异及基因间相关性。

1.8 HE染色

胰腺组织室温下用4%甲醛溶液固定24 h，病理切片厚度5 μm，使用HE染色试剂盒，苏木精染液染色5 min，自来水冲洗5 s；分化液分化2 s，自来水冲洗20 s；伊红染色1 min，自来水冲洗5 s；最后，脱水、透明、封片。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 ob/ob小鼠与C57BL/6J组织病理形态学

C57BL/6J小鼠组胰腺内胰岛结构清晰规则，边界分明，胰岛细胞排列有序，形态清晰，胞质丰富，ob/ob小鼠可见胰岛增生、肥大，岛内β 细胞核增多、密集，胞质减少，排列紊乱(图1)。

图1 ob/ob小鼠与C57BL/6J胰岛HE染色结果

2.2 差异基因筛选

盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况，发现基因表达水平分布大致相同(图2A)。使用edgeR，筛选出符合条件的差异基因(logFC≥2或logFC≤-2，P<0.05)。其中ob/ob较C57BL/6J小鼠上调基因88个，下调基因94个，共182个(图2B)。火山图直观展示每个比较组合的差异基因分布情况，着重显示上调和下调前10位的基因(图2C)。

图2 差异基因筛选A为18只小鼠基因表达分布情况；B为ob/ob小鼠与C57BL/6小鼠差异基因热图，蓝色为ob/ob小鼠，粉色为C57BL/6小鼠，红色为基因在C57BL/6较ob/ob高表达，绿色为基因在C57BL/6较ob/ob低表达；C为差异基因火山图，红色为基因在C57BL/6较ob/ob高表达，蓝色为基因在C57BL/6较ob/ob低表达。

2.3 差异基因的GO和KEGG分析

利用DAVID数据库对182个差异基因进行生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)的GO功能注释，P<0.05的生物功能被认为有意义。这些基因生物学功能主要涉及支链氨基酸分解代谢过程、翻译起始调控、自噬的正调控、氨基酸转运、神经管封闭、细胞增殖的正调控、N-聚糖加工、蛋白质折叠；细胞组织涉及细胞外泌体、核糖体、细胞内核糖核蛋白复合物、线粒体内膜、胞质大核糖体亚基、线粒体、髓鞘、胞质小核糖体亚基和蛋白质复合物；分子功能主要为核糖体的结构成分、poly(A)RNA结合、催化活性、丝氨酸型肽酶活性、碳水化合物结合、转氨酶活性、翻译起始因子结合、肽酶活性、mRNA结合和丝氨酸型内肽酶活性(图3A、B、C)。

图3 差异基因的GO和KEGG分析A为差异基因生物过程分析(BP)；B为差异基因细胞组成分析(CC)；C为差异基因分子功能分析(MF)；D为差异基因信号通路分析。

KEGG信号通路集中在核糖体(mmu03010)、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢(mmu00260)、氨基酸的生物合成(mmu01230)、内质网中的蛋白质加工(mmu04141)、蛋白质的消化吸收(mmu04974)、精氨酸的生物合成(mmu00220)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢(mmu00250)、GABA能突触(mmu04727)、前列腺癌(mmu05215)和雌激素信号通路(mmu04915)(图3D)。P<0.05的生物功能被认为有意义。

2.4 Hub基因筛选

利用STRING构建了POP差异基因的PPI网络(图4A)，节点数165为边数410，平均节点度为4.97，平均局部聚类系数为0.524。使用Cytoscape的cytohubba筛选差异基因前10位的中枢基因，分别为RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a(图4B)。用Cytoscape的MCODE构建中枢基因模型，发现与cytohubba类似(图4C、D)，Rpl34、Eif3m、Rpl22l1、Rpl24、Rpl23a-ps3、Eef1a1、Rps27a、Rpsa-ps10、Rpl17、Rps7、Rpsa、Btf3、Rps4x、Gm8730、Rps3a1、Gm7536、Rps15a、Rps12-ps3、Rpl7、RPl38。

图4 中枢基因(hubgene, Hub)分析A为差异基因的蛋白质-蛋白质互相作用网络；B为差异基因前10位的中枢基因；C为Cytoscape中MCODE构建中枢基因模型；D为Cytoscape中MCODE构建中枢基因模型。

2.5 Hub基因相关性分析

用corrplot包对前10位hub基因RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a进行相关性分析，除Rpl7与Rps27a呈负相关外，其余均成正相关。红色代表正相关，蓝色代表负相关，颜色越深表明相关程度越高(图5)。

图5 中枢差异基因相关性分析红色代表正相关，蓝色代表负相关。

2.6 Hub基因差异性分析

用vioplot包对前10位Hub基因在ob/ob小鼠C57BL/6J小鼠两组表达量分析，Hub基因在ob/ob小鼠中均较C57BL/6J小鼠低表达，具有统计学意义(P<0.05;图6)。

图6 中枢差异ob/ob小鼠与C57BL/6小鼠差异分析蓝色为ob/ob小鼠，红色为C57BL/6小鼠。各中枢基因在ob/ob小鼠组表达量较C57BL/6低。

3 讨 论

真核细胞质中核糖体是由4种不同的核糖体RNA(ribosomal RNAs, rRNA)[10]和80种核糖体蛋白(ribosomal proteins, RPs)[11]组成的高度结构的大分子复合体，它们在翻译合成新蛋白质的遗传密码中起着核心作用。这两个不相同但互补的功能被分成两个核糖体亚基：分别是40 S小亚基和60 S大亚基[12]。核糖体蛋白是核糖体复合物的主要成分，其功能对于细胞生长，增殖和体内平衡至关重要[13]。因此，核糖体的催化活性是由rRNA控制的，但许多RP在翻译的不同步骤和方面起着重要作用。

X-连锁的鼠核糖体蛋白S4(Rps4x)是核糖体复合体的40 S亚基的一个组成部分，人类RPS4X单倍体功能不全在Turner综合征中起着重要作用[14]。先前的研究表明，RPS4X可能在肿瘤进展中起重要作用，并证明RPS4X在乳腺和卵巢癌细胞系中与Y-box结合蛋白-1(YB-1)有物理上的相互作用，被确定为卵巢癌和膀胱癌的独立预后因素[15]。一些研究表明，Rps27a可能是间充质干细胞治疗T2DM的潜在靶点[16]。本研究发现10个核糖体蛋白基因(RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a)与瘦素缺陷ob/ob小鼠发生T2DM相关，且较C57BL/6J小鼠表达水平低。RP具有协调核糖体结构和蛋白质生物合成以维持细胞内稳态的复杂作用，还具有复制、转录、RNA加工和DNA修复的功能。RP基因的上调可能是由于核糖体合成速率的增加，以支持蛋白质翻译、转录激活、mRNA稳定和DNA修复等活动。因此推测，RPs水平的降低可能影响rRNA加工中的关键蛋白的功能[17]，从而可能导致T2DM的发生。

本研究发现10个核糖体蛋白基因(RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a)与瘦素缺陷ob/ob小鼠发生T2DM相关，且较C57BL/6J小鼠表达水平低。RP具有协调核糖体结构和蛋白质生物合成以维持细胞内稳态的复杂作用，还具有复制、转录、RNA加工和DNA修复的功能。RP基因的上调可能是由于核糖体合成速率的增加，以支持蛋白质翻译、转录激活、mRNA稳定和DNA修复等活动。

高水平的线粒体大核糖体亚单位蛋白40可以防止酵母中线粒体DNA的丢失，然而在哺乳动物中仍没有发现线粒体核糖体蛋白与代谢疾病之间相关的证据，因此推测，RP水平的降低可能影响rRNA加工中的关键蛋白的功能[17]，下调了胰腺中的细胞凋亡，从而可能导致T2DM的发生。

REG1是一种分泌型蛋白，小鼠的Reg基因位于6号染色体37的一个连续区域，研究发现，REG1在胰腺外分泌腺泡细胞中表达，并分泌到胰管中。据报道，REG1在再生和增生的胰岛中也有特异性表达，但在正常的胰岛、肝脏或脑中表达较少。然而，本研究发现ob/ob小鼠Reg1较C57BL/6J小鼠显著降低，模型4D显示Reg1可能与糖尿病发生密切相关，这恰恰证实了REG1蛋白是β细胞增殖和新生的刺激因子，对胰岛β细胞复制和导管细胞新生过程中发挥重要作用。

本研究揭示了核糖体蛋白和Reg1蛋白调控网络在ob/ob小鼠中可能导致T2DM发病机制，发现了一些未见报道的T2DM相关的基因，之后的研究需要验证筛选出的PRs基因在T2DM患者中的表达水平，明确与这些基因相关的分子机制。

综上所述，本研究描述了可能与T2DM发生发展相关的分子机制，寻找出与之相关的相关基因，为之后研究T2DM发生发展机制提供了重要线索。