吴伟，冯儒庭，韩琳

1.九江学院附属医院，江西 九江 332000；2.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330000

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并发症之一，发病率呈逐年增长趋势［1］，发病机制尚不完全清楚，疾病最终将进展至终末期肾衰竭，给患者、家庭、社会带来沉重负担，这就需要医药工作者探索新的治疗方法。黄连素来源于黄连、黄柏等含小檗碱的中药，属异喹啉生物碱，亦可人工合成。目前多项动物和临床研究发现，黄连素可降低血糖、降低血脂、减轻炎症反应等保护肾脏［2］。系统评价是全面收集符合研究问题的文献进行定性，并严格评估文献，最后提供可靠的研究结果，被公认为是卫生保健决策的高质量研究［3］。本研究将对黄连素治疗DN的动物和临床研究进行全面评价和比较，旨在发现黄连素对DN的治疗作用，也为DN的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 纳入标准所有黄连素和小檗碱治疗DN的动物和临床研究均被纳入。

1.2 排除标准排除非DN的研究、非随机对照试验研究、细胞研究、综述研究、联合用药研究、雷同和重复的研究。

1.3 资料来源与检索策略两名研究者（冯儒庭、韩琳）独立用“黄连素”或“小檗碱”和“DN”或“糖尿病”“肾”或“蛋白尿”或“尿蛋白”为主题词分别检索中国知网数据库、万方数据库、维普数据库，中国生物医学文献数据库；用“berberine”和“diabetic nephropathy”或“diabetic”“renal”或“kidney”主题词检索Pubmed数据库，检索时间均是建库时间至2019年12月31日。手工检索中国中西医结合学会肾脏病专业委员会学术大会、中华中医药学会糖尿病分会会议等重要会议论文汇编，检索截止时间至2019年12月31日。

1.4 资料提取两名研究者（吴伟、韩琳）独立地对纳入研究进行资料提取，提取内容包括论文题目、作者、发表年份、受试对象或动物种属特征、研究设计、干预措施、不良事件、结果指标和结论等，完成后相互核对，如有不同，由第三者（冯儒庭）协助判断。

1.5 质量评价动物实验文献质量评价选择ARRIVE指南［4］和SYRCLE动物实验偏倚风险［5］评估工具。临床试验文献质量评价选择2010年版CONSORT声明和Cochrane风险偏倚评估工具［6］。

1.6 统计学方法动物和临床研究分别进行系统评价和Meta分析，并运用RenMan 5.1软件进行操作，计数资料用比值比或相对危险度为合并效应量，计量资料用均数差或标准化均数差为合并效应量；因造模方式、给药剂量等不同，应用亚组分析；若I2≥50%，选随机效应模型分析，若I2＜50%，选固定效应模型分析；同质性较好的资料应用敏感性分析；不能合并的资料，进行描述性评价；绘制漏斗图分析发表偏倚情况；最后对结果进行分析讨论。

2 结果

2.1 文献检索结果初检文献包括中文文献101篇，英文文献30篇，阅读论文逐一筛选，最终纳入分析有29篇文献，排出细胞研究21篇、非DN研究12篇、综述9篇、联合用药14篇、非随机对照研究2篇、数据不全2篇、撤稿2篇、雷同文献40篇（雷同文献选用数据最新或最全者）。检索流程见图1。

图1 文献检索流程图

2.2 文献基本特征29篇文献包括中文23篇、英文6篇，均为随机对照实验，研究地点均在中国。动物实验26篇［7-32］，均是大鼠或小鼠的研究，造模方式有诱发性糖尿病模型［四氧嘧啶（200 mg）腹腔注射［7，11］，链脲佐菌素（50～150 mg·kg-1）腹腔注射［8-10，13，15，20，24，27-28，30，32］，高脂饲料联合链脲佐菌素（25～60 mg·kg-1）腹腔注射或尾静脉注射［12，14，16-19，22-23，31］，单 肾 切 除 联 合 链 脲 佐 菌 素（60 mg·kg-1）腹腔注射［25］］和自发性糖尿病模型（Zucker大鼠8周龄［21，26］、KKAy小鼠8周龄［29］），成模标准为空腹血糖＞11.1～16.7 mmol·L-1。给药方式均是灌胃，给药剂量在25～400 mg·kg-1，给药疗程在4～20周。临床试验3篇［33-35］，均是DNⅢ期的研究，对照组均为空白对照，给药剂量为20～300 mg·kg-1，观察疗程为3周～6个月。

3 结果

3.1 报告规范参照ARRIVE指南，26篇动物实验均对标题、摘要、背景、目的、实验步骤、实验动物、样本量、动物实验分组、实验结果、统计学方法、基线数据、统计学分析、结果和评价等有完整描述；14篇［7-12，14，21，27-32］对伦理声明有描述；6篇［8，15，22-23，25，31］对不良事件有描述；16篇［7-8，10-11，13-16，18，24-25，27，19-32］对基金支持有描述；26篇对研究设计描述不完整，均未描述实验是否施盲，2篇［21，23］描述了实验单位；9篇［8，14-17，18，22，27，32］对饲养场所和饲养描述不完整，未描述实验温度和湿度、动物进食进水情况；26篇对诠释／科学内涵描述不完整，均未描述3R原则的意义；20篇［9，11-12，14，16-22，24-32］对概括／转换有描述，认为可以进一步研究或在临床应用。

参照2010年版CONSORT声明，3篇临床试验对标题与摘要、引言、试验设计、研究对象、干预措施、结局指标、统计学方法、基线数据、可推广性等有完整描述；3篇均未描述样本量的确定方法、分配隐藏、盲法、局限性、试验注册；1篇［33］描述了随机方法，1篇［33］描述了危害，1篇［34］描述了资助。

3.2 方法学质量评价参照SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具，26篇动物文献在选择、实施和测量偏倚均呈高度偏倚风险；失访和报告偏倚均呈低度偏倚风险；其他偏倚均呈偏倚风险不确定。

参照Cochrane风险偏倚评估工具，3篇临床试验在选择偏倚1篇［33］呈低度偏倚风险，2篇呈高度偏倚风险；实施和测量偏倚均呈高度偏倚风险；随访和报告偏倚均呈低度偏倚风险；其他偏倚均呈偏倚风险不确定。

3.3 模型评价目前，尚无DN动物模型标准［36］，不同模型或将探索与人类更加接近的疾病过程。比较26项动物实验的正常组与模型组的血糖、尿蛋白、肾功能，均有统计学意义（P＜0.05），自发性、诱发性模型肾脏病理学变化，均表现为肾小球扩张或系膜基质增生，与人类早期DN病理损伤肾小球代偿性增大、系膜基质增多相同，结合尿蛋白、肾功能结果，认为DNⅢ期模型均制备成功。

3.4 Meta分析Meta分析，即定量系统评价，它是全面收集符合纳入标准的研究，并进行定量合成，从而得出综合结论的研究方法，是高级别循证证据之一。

3.4.1 尿蛋白 动物实验中有15篇研究报道了尿蛋白。8篇［9-11，13，21，23-24，27］检测了24 h尿蛋白，6篇［7，15-16，29，31-32］检测了24 h尿白蛋白，1篇［8］检测了尿白蛋白排泄率，故进行亚组分析。结果显示：I2＝79%，SMD＝-2.48，95%CI（-3.2，-1.76），P＜0.01，黄连素组较模型组可降低尿蛋白水平。在各亚组研究中，两组差异均有统计学意义（P＜0.01），见图2。临床试验有1篇［33］研究报道了尿蛋白，黄连素组较空白对照组可明显降低尿白蛋白排泄率（P＜0.05）。以上结果均提示，动物实验与临床试验的结果具有一致性，黄连素可降低尿蛋白水平。

图2 动物实验黄连素组与模型组尿蛋白比较的Meta分析

3.4.2 肾脏指数 动物实验中有13篇研究报道了肾脏指数。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝85%，SMD＝-2.59，95%CI（-3.48，-1.69），P＜0.01，黄连素组较模型组可减轻相对肾脏质量。其中1篇［29］自发性模型和12篇［7-11，13，16，19，22-23，27，32］诱发性模型的亚组研究发现，黄连素组较模型组可减轻相对肾脏质量（P＜0.01），见图3。DN发病机制复杂，不同模型研究，揭示药物对多种致病因素的作用，有利于发现药物多靶点机制，对DN的多途径进行控制。

图3 动物实验黄连素组与模型组肾脏指数Meta分析

3.4.3 血肌酐 动物实验中有19篇研究报道了血肌酐。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝97%，MD＝-22.58，95%CI（-28.54，-16.62），P＜0.01，黄连素组较模型组可降低血肌酐水平。其中18篇［7，9-16，21-24，26-27，29，31-32］未单肾切除和1篇［25］单肾切除的亚组研究发现，黄连素组较模型组可降低血肌酐水平（P＜0.01），见图4。临床试验有2篇［34-35］研究报道了血肌酐，黄连素组较空白对照组不能降低血肌酐水平，结果显示：I2＝0%，MD＝-2.42，95%CI（-6.0，1.17），P＞0.05，见图5。动物研究与临床研究不一致，与样本量有关，也与动物实验模型组只给予生理盐水，临床试验对照组有基础降糖作用，血糖对模型组肾脏损伤也有关，有待今后大样本研究证实。

图4 动物实验黄连素组与模型组血肌酐Meta分析

图5 临床试验黄连素组与对照组血肌酐Meta分析

3.4.4 血糖 动物实验中有19篇研究报道了血糖。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝91%，MD＝-8.75，95%CI（-10.49，-7.01），P＜0.01，黄连素组较模型组可显著降低血糖水平。其中17篇［7-11，13，15-17，21-25，27，30-32］诱 发 性 模 型 和2篇［21，29］自发性模型的亚组研究发现，黄连素组较模型组可降低血糖水平（P＜0.01），见图6。临床试验有3篇研究报道了血糖，黄连素组较空白对照组可降低血糖水平，结果显示：I2＝91%，MD＝-1.23，95%CI（-2.39，-0.06），P＜0.05，见图7。动物研究与临床研究结果是一致的。

图6 动物实验黄连素组与模型组血糖Meta分析

图7 临床试验黄连素组与对照组血糖Meta分析

3.4.5 胰岛素 动物实验中有4篇研究报道了胰岛素。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝95%，MD＝0.10，95%CI（-1.74，1.93），P＞0.05，黄连素组较模型组对胰岛素水平无影响。其中2篇［17，23］诱发性模型和2篇［21，26］自发性模型的亚组研究发现，黄连素组较模型组对胰岛素水平无影响（P＞0.05），见图8。推测黄连素降糖可能不依赖于胰岛素水平。

图8 动物实验黄连素组与模型组胰岛素Meta分析

3.4.6 胆固醇 动物实验有6篇研究报道了胆固醇。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝98%，MD＝-1.95，95%CI（-2.72，-1.18），P＜0.01，黄连素组较模型组可降低胆固醇水平。其中5篇［16，17，21-22，26］高脂饮食和1篇［9］非高脂饮食的亚组研究发现，黄连素组较模型组可降低胆固醇水平（P＜0.01），见图9。临床试验有1篇［34］研究报道了黄连素组较空白对照组可降低胆固醇水平（P＜0.05）。

图9 动物实验黄连素组与模型组胆固醇Meta分析

3.4.7 三酰甘油 动物实验有6篇研究报道了三酰甘油。因造模方式不同，故进行亚组分析。结果显示：I2＝97%，MD＝-1.22，95%CI（-1.90，-0.53），P＜0.01，黄连素组较模型组可降低血浆三酰甘油水平。其中5篇［16，17，21-22，2］］高脂饮食和1篇［9］非高脂饮食的亚组研究发现，黄连素组较模型组可降低血浆三酰甘油水平（P＜0.01），见图10。临床试验有1篇［34］研究报道了黄连素组较空白对照组可降低血浆三酰甘油水平（P＜0.05）。

图10 动物实验黄连素组与模型组三酰甘油Meta分析

3.5 描述性分析

3.5.1 PI3K 有1篇［18］研究报道了黄连素组较模型组能上调肾脏组织PI3K表达。提示肾脏保护作用可能与黄连素上调肾脏PI3K表达有关。

3.5.2 Nrf2 有1篇［20］研究报道了黄连素组较模型组能上调肾脏组织Nrf2表达。提示肾脏保护作用与黄连素上调肾脏Nrf2表达有关。

3.5.3 TLR4 有1篇［28］研究报道了黄连素组较模型组能下调肾脏组织TLR4表达。提示肾脏保护作用与黄连素下调肾脏TLR4表达有关。

3.6 敏感性分析排除由于动物种属、造模方式、给药疗程不同增加异质性对结果的影响，故进行敏感性分析进一步评价黄连素的疗效。诱发性模型中有2篇［10，27］研究动物种属、造模方式、给药疗程相同。

3.6.1 24 h尿蛋白 黄连素组与模型组比较，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-1.37，95%CI（-2.07，-0.66），P＜0.01，黄连素组较模型组能降低24 h尿蛋白水平。见图11。

图11 动物实验黄连素组与模型组尿蛋白敏感性分析

3.6.2 肾脏指数 黄连素组与模型组比较，Meta分析示：I2＝49%，MD＝-0.45，95%CI（-0.51，-0.39），P＜0.01，黄连素组较模型组能降低肾脏指数。见图12。

图12 动物实验黄连素组与模型组肾脏指数敏感性分析

3.6.3 血肌酐 黄连素组与模型组比较，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-50.49，95%CI（-61.18，-39.81），P＜0.01，黄连素组较模型组能降低血肌酐水平。见图13。

图13 动物实验黄连素组与模型组血肌酐敏感性分析

3.6.4 血糖 黄连素组与模型素组比较，Meta分析示：I2＝0%，MD＝-10.64，95%CI（-13.56，-7.71），P＜0.01，黄连素组较模型组能降低血糖水平。见图14。

图14 动物实验黄连素组与模型组血糖敏感性分析

3.7 漏斗图发生偏倚很难避免，在实施Meta分析时，必须对存在的偏倚的可能性进行检测。最常用的就是漏斗图法，漏斗图的表达方式可以比较直观的目测有无偏倚。漏斗图不对称越明显，存在发表偏倚的可能性就越大。一般推荐Meta分析的研究对象在10个及以上才需做漏斗图。动物实验中血糖的报道的文献数量最多，故进行有血糖研究的漏斗图显示：图形不对称，认为存在发表偏倚，见图15。临床试验只有3篇文献，文献数量少，未进行漏斗图检测。

图15 含血糖研究文献的漏斗图

3.8 不良事件动物实验有6篇研究报道了不良事件，均是诱发性模型。3篇［22-23，31］是造模失败，3篇［8，15，25］是实验中有大鼠死亡，死亡原因有高血糖、感染、灌胃窒息。临床试验有1篇描述试验中无不良事件发生。其他研究未报告不良事件，可能也并无不良事件发生。

4 讨论

目前，DN的发病机制尚不明确，也无特效疗法。通过动物实验研究则可直接探索疾病过程，也可发现有疗效的药物。系统评价动物实验可进一步验证实验结论，可靠性较强。对动物实验和临床试验进行全面系统评价和Meta分析，将肯定动物模型的再现性、动物实验研究的价值，并发现大样本的治疗效果、分析治疗结果的同异性，药物作用和疾病发生机制，以增强临床疗效，两者也都是循证决策的依据［37］。

本研究参照ARRIVE指南和SYRCLE动物实验偏倚风险评估两种工具，有力地评价了文献质量，也指明了今后研究方向。26篇动物实验文献报告欠完整，尤其对研究设计中施盲、诠释／科学内涵中3R原则的描述不足，方法学质量存在一定的偏倚风险，对分配隐藏、盲法实施的不够。参照2010年版CONSORT声明和Cochrane风险偏倚评估两种工具，更加说明了文献质量的高低，指导今后研究的质量要求。3篇临床试验文献报告亦欠完整，对方法、讨论描述的不完整，方法学质量也存在一定的偏倚风险。

本研究发现，多种自发性、诱发性动物模型均呈现DNⅢ期的表现，可再现黄连素对早期DN的治疗作用。系统评价和Meta分析显示，黄连素在动物实验和临床研究中均可降低尿蛋白、血糖、胆固醇和三酰甘油水平，其中动物实验显示，黄连素可降低肾脏指数、血肌酐水平及下调肾脏组织TLR4表达、上调肾脏组织PI3K和Nrf2表达。尿蛋白、肾脏指数、血肌酐、血糖、胆固醇、三酰甘油水平的降低，与下调肾脏组织TLR4表达和上调PI3K和Nrf2表达有关。动物实验和临床研究中血肌酐水平的结果不一致，可能与样本量有关，也可能与动物模型组只用生理盐水灌胃，临床试验对照组均有控制血糖药物等基础治疗，高血糖对模型动物肾脏损害更大有关。黄连素能降低高脂饮食模型、非高脂饮食模型大鼠的胆固醇、三酰甘油水平，提示黄连素的降脂机制不仅仅是抑制饮食的吸收。研究发现，黄连素上调PI3K表达，下调TLR4表达，可见黄连素调控PI3K信号分子不依赖于TLR4［38］。敏感性分析可提高研究间的同质性，应用固定效应模型结果显示，黄连素可降低血糖水平、肾脏指数、24 h尿蛋白、血肌酐水平。动物和临床研究不良事件发生率低，成模率高、未见药物不良反应报道，黄连素应用安全可靠。动物实验漏斗图示存在发表偏倚，临床试验只有3篇文献未行漏斗图检测。

动物实验和临床研究质量均有一定的偏倚，动物实验间异质性较大，临床试验数量少，这些均可能过高地估计了黄连素对DN的治疗效果，望有更多高质量研究进一步评价黄连素的药理作用。