汪玉龙，周鹏鹏，郝维敏

（安徽医科大学附属宿州医院，安徽 宿州 234000）

0 引言

肺炎克雷伯菌（KPN）属革兰阴性肠杆菌科细菌，常定植在住院患者的肠道和呼吸道内，引起消化道、呼吸道、泌尿道、血液、颅内、手术切口及皮肤软组织等部位的感染，现已成为院内感染重要的致病菌之一[1]。近年来广谱抗生素的广泛应用和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的产生，导致KPN对一线、二线抗菌药物及β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加。2013年美国疾病预防控制中心（CDC）报告显示耐药的淋球菌、耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌和艰难梭菌已成为目前对公众健康威胁最大的3种细菌[2-3]。国内耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）于2007年由浙江大学学者首次发现报道，此后十多年各地陆续出现相关报道，由CHINET和Mohnanarin全国细菌耐药检测结果可见，CRKP的检出率由2011年的3.2%升至2015年的7.6%，2015年上海市CRKP检出率更是达到20%。造成KPN对碳青霉烯类抗生素耐药的因素较多，了解CRKP耐药基因分布及其耐药机制，通过脉冲场凝胶电泳进行同源性分析以及MLST的细菌分型方法进行流行病学分析进一步了解该院情况，对解决细菌耐药问题及指导临床合理用药及预防院内流行爆发具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料。收集该院2019年1月至2020年12月临床标本分离得到的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌80株，去除重复株。质控菌株肺炎克雷伯菌（ATCC 1705、ATCC 1706）和大肠埃希菌（ATCC 25922、ATCC 8739）均由卫生部临床检验中心提供。阳性对照菌株KPC-2、TEM、NDM-1均来自该院检验科。

1.2 主要仪器及试剂。MH平板、BP平板、MAC平板、VITEK 2 COMPACT自动微生物分析仪、革兰阴性菌鉴定药敏卡均购于法国梅里埃公司，PCR扩增仪购于美国赛默飞公司 ，琼脂糖及引物序列均由上海生工生物公司提供，DNA marker及Premix TaqTM均由日本TaKaRa公司提供，脉冲场凝胶电泳仪、凝胶成像系统来自北京君益东方公司，药敏纸片由英国Oxoid公司提供。

2 研究方法

2.1 药敏测定。严格按照《全国临床检验操作规程》进行分离培养所得临床菌株并应用VITEK 2 COMPACT自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验，同时用纸片扩散法进行补充。结果判读依照2020版CLSI标准判读。

2.2 基因扩增。提取待测菌株DNA，引物见表1，PCR扩增体系为2×TaqPCRGreenMix（12.5 ul），模板（2.5 ul），上下游引物各1ul，DD H2O（8 ul），共25 ul的PCR反应体系。按照查阅的扩增条件进行扩增，并将扩增产物放在凝胶成像仪中观察记录。

2.3 PFGE检测。调待测菌悬液浓度在3.8个麦氏点左右，加入1% Seakem Gold SDS胶制备胶块，再用蛋白酶K进行裂解消化，纯水清洗2遍再用TE清洗4次每次15 min左右并进行酶切孵育，按照参考文献电泳条件进行实验，并将结果进行聚类分析[4-5]。

2.4 MLST分型。查阅MLST分型资料得知肺炎克雷伯含有7个管家基因（gap、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），并进行扩增，对扩增产物进行测序分析。最后将测序结果在肺炎克雷伯MLST数据库进行比对确定序列型，详情见表1。

表1 PCR引物序列

3 结果

3.1 菌株分布。80株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯标本类型占比分别为：痰液45株（56.2%）、尿液12株（15%）、导管尖7株（8.7%）、引流液10株（12.5%）、血液6株（7.5%）。

3.2 药敏结果。药敏试验显示，CRKP对阿米卡星敏感率为51.7%，对环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦等常见抗生素均具有较高耐药率（＞70%），对头孢唑林、头孢他啶、头孢替坦及头孢吡肟耐药率为100%，详见表2。

表2 80株菌株对常见抗生素药敏情况

3.3 耐药基因检测结果。80株菌中检测出有64株携带KPC-2基因（80%），4株携带NDM-1基因（5%），产KPC型肺炎克雷伯菌有53株携带TEM基因（82.8%）,未发现新的基因亚型。部分电泳结果见图1。

图1 部分菌株KPC基因PCR扩增电泳图

3.4 PFGE分型结果。将80株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行脉冲场凝胶电泳，分析结果可把80株CRKP分为A1～A17不同带型，其中A10带型占比最多为16株，其次是A14为14株，每种带型都包括1株到多株菌不等。在A10带型中菌株16、77、50、36、75均来自该院ICU病房，可见存在一定的小范围菌株流行情况，

3.5 MLST分型。PFGE聚类分析和MLST分析显示产KPC-2型菌株主要为ST11型和ST395型，产NDM-1型菌株为ST263-F型和ST15-C型。ST11是主要型，占比81.3%（65/80）。其中ST526，ST45，ST395，只测得各1株，ST258，ST307检测出3株。

4 讨论

目前临床应用的所有β-内酰胺类抗菌药物中碳青霉烯类抗菌药物抗菌活性最为广泛，对产AmpC酶和ESBLs的革兰阴性菌具有较好的治疗效果，是目前革兰阴性菌治疗效果最强的β-内酰胺类药物[6]。但随着近年来药物在临床的应用，细菌耐药的相关逐渐增多。碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制主要包括以下几个方面：①碳青霉烯酶的产生，按照氨基酸序列的相似程度，可将其分为四类，A、B、D类碳青霉烯酶均具有水解碳青霉烯的活性，A类酶将导致细菌对头孢菌素、青霉素、氨曲南和碳青霉烯类耐药，肠杆菌科细菌中A类酶主要包括IMI、KPC及部分GES类型；B类酶为金属β-内酰胺酶（即金属酶），能够水解除单酰胺环类外的全部β-内酰胺类抗菌药物，主要包括VIM、NDM及IMP；D类酶能够水解氯唑西林和苯唑西林，多见于假单胞菌属、不动杆菌属及肠杆菌科，目前肺炎克雷伯菌中主要为OXA-48型[7-8]。②外膜孔蛋白的缺失或表达水平下降，革兰阴性菌外膜的蛋白通道是抗菌药物进入细菌的重要途径，膜孔蛋白能够特异性导入β-内酰胺类抗菌药物，当外膜孔蛋白缺失或表达水平下降时，导致其通透性改变，抗菌药物无法进入细菌发挥作用[9-10]。CRKP相关外膜孔蛋白主要包括OmpK35、OmpK36、OmpK37。OmpK35和OmpK36蛋白的缺失或表达水平的下降将导致细菌对抗菌药物敏感性降低，OmpK37常处于休眠状态，仅在OmpK35和OmpK36蛋白缺失时会上调表达水平，OmpK37高表达时碳青霉烯最低抑菌浓度将下降，OmpK37蛋白缺失或表达水平下降时，即出现细菌耐药[11-12]。③靶位蛋白改变，青霉素结合蛋白（PBPs）是β-内酰胺类作用的靶点，PBPs结构改变时与β-内酰胺类抗菌药物亲和力降低或不结合，对细胞壁合成粘肽的阻碍作用减弱或消失，对细菌细胞壁的破坏作用降低，出现耐药[13-14]。目前研究主要发现PBP2位点减少或缺失，但不排除其他位点对碳青霉烯耐药的影响，仍需进一步研究[15]。④主动排外机制，细菌外排泵能主动将抗菌药物排出至菌体外，导致菌体内药物浓度降低，产生耐药性。AcrAB-TolC是肺炎克雷伯菌最主要的外排泵，有研究指出外排泵导致耐药性的产生与外膜通透性间具有一定关系，菌体主要外排抗菌药物的速度超过药物通过外膜孔蛋白进入菌体的速度时将表现为细菌耐药，否则菌体仍对药物敏感[16]。

CRKP对大多抗菌药物耐药，仅有少数抗菌药物能够发挥作用。本研究中80株CRKP对阿米卡星敏感率为51.72%，对环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦等常见抗生素均具有较高耐药率（＞70%），对头孢唑林、头孢他啶、头孢替坦及头孢吡肟耐药率为100%，大大增加了临床治疗难度。本研究选取80株CRKP菌株，由此可见CRKP因携带不同碳青霉烯酶基因而呈现不同基因分型[17-18]。

因菌株的耐药性，基因型及流行分布会因地域或时间不同而存在差异，此次研究对了解该院的情况有重要意义，从检测的基因结果表明该院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌主要携带KPC-2基因，检出率为80%，肺炎克雷伯菌耐药机制最主要就是产KPC酶，以KPC-2为主，较国内其他地区研究相似。接下来会进一步从转座子，质粒介导等方面进一步研究菌株耐药基因的水平传播，这也是引起院内感染爆发的原因[19]。从同源性分析来看在A10带型中菌株16、77、50、36、75均来自该院ICU病房，可见该院存在小部分流行爆发情况，应引起该院重视采取合理有效地措施进行防止菌株流行的延续。有研究表明产NDM 阴沟肠杆菌MLST主要为ST93型[20]。该院研究有2株携带TEM基因的菌株的分型分别为ST258，ST307，可见相同耐药基因会有不同的分型，这也是耐药机制的复杂性之一，也进一步完善耐药方面的研究。

综上所述，耐药基因在不同菌株、菌种及菌属之间的传递，也造成了细菌耐药性的播散，我们应对碳青霉烯类耐药情况密切关注，及时采取有效地控制措施，控制和减少院内交叉感染的发生。