徐欢欢，李逸，高伟，王永勤，刘乐承

洋葱γ-谷氨酰转肽酶的克隆与鉴定

徐欢欢1,2，李逸1，高伟1，王永勤2，刘乐承1

1长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025；2北京市农林科学院蔬菜研究中心/农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/蔬菜种质改良北京市重点实验室，北京 100097

【】葱属植物代谢产生的蒜氨酸具有重要的药学价值，γ-谷氨酰转肽酶是蒜氨酸合成中作为脱谷氨酰化步骤的关键酶。研究洋葱γ-谷氨酰转肽酶基因的功能，揭示γ-谷氨酰转肽酶在洋葱蒜氨酸合成途径中的作用，为体外合成蒜氨酸提供理论依据，为进一步深入研究洋葱蒜氨酸合成机制奠定基础。以洋葱为材料，依据洋葱RNA-seq数据库设计引物，利用RT-PCR从洋葱中克隆γ-谷氨酰转肽酶基因，并进行生物信息学分析；构建CaMV 35S-AcGGT-GFP载体，利用微粒轰击技术，以金粉-质粒微载体轰击洋葱内表皮细胞，构建带有的酿酒酵母表达载体，转化并诱导表达，利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定转入的酿酒酵母总蛋白的谷氨酰转肽酶活性；利用实时荧光定量PCR方法分析该基因在洋葱组织间差异表达模式；利用γ-谷氨酰转肽酶催化谷氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺的方法测定组织间内源性转肽酶酶活性。克隆获得，长度为1 869 bp；生物学信息学分析显示，洋葱编码622个氨基酸，蛋白保守结构域预测显示具有谷氨酰转肽酶结构域，二级结构主要以α-螺旋为主，跨膜区分析推测GGT蛋白具有跨膜区，氨基酸多重比对结果显示植物中的GGT具有一定的保守性，进化分析表明AcGGT与大蒜AsGGT2亲缘关系最接近。……