石颖， FAISAL Islam， 周伟军， 王尖

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

杂草是适应作物气候条件、农耕制度、栽培方式等生态环境而生存的植物[1]，它们与作物争夺光照、肥料、空间，影响其光合作用，阻碍生长，严重危及粮食生产的安全与稳定。杂草是影响作物产量的重要因素之一，应用化学除草剂防除杂草是一项重要的技术措施。而激素类除草剂由于其具有高选择性、广谱性、效果好及低成本的特性，在世界范围内大量使用的历史已超过60 a[1]。其中2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)，是一种广泛使用的苗前/后激素类内吸选择性除草剂，对植物有相当强的选择作用。2,4-D对大多数阔叶类杂草具有显著防除效果，同时在水中具有极好的溶解性，能够使有效成分在植物叶片和根中迅速传递，截止目前仍在世界各地的杂草防除中起着重要作用[2]。2,4-D能够模拟植物内源激素调节植物生长，促进细胞分裂和增长，低浓度下能够增加结实率[3]。本文通过全面地归纳总结2,4-D对作物与生态环境的影响及使用情况，探究2,4-D在环境中的传播途径和分布，为2,4-D更好、更安全地使用提供借鉴，同时为今后除草剂筛选及合理使用提出新的思考。

1 2,4-D在自然环境中的分布与存在形态

纯的2,4-D在水中的溶解度低，仅微溶于水。因此，生产上常用的制剂一般可以分成胺盐、脂类和胆碱盐等[4]。2,4-D的降解时间根据环境的不同大约在20 d到312 d之间不等[5]。由于2,4-D的低吸附系数和高水溶性，在地表和地下水中都能检测到2,4-D的存在。2,4-D在自然环境中的分布如表1所示，2,4-D已广泛存在于食物、空气、水体中，并对人类健康造成不同程度的危害。

表1 2,4-D的分布和含量

2 2,4-D的代谢和降解

2,4-D在土壤中的降解是一个逐渐衰减的过程，同时也受生物和非生物环境的影响。通常情况下，2,4-D能够在生物和非生物的互相作用下在处理后的几天之内降解，但仍有2%的2,4-D会残留在土壤中，如果残存超过9个月就会影响对2,4-D敏感的后茬作物。2,4-D残留的原因可能是土壤中缺乏能够代谢2,4-D的微生物或者微生物数量太少。表2列举了近些年研究证实有代谢2,4-D潜力的微生物菌株。微生物降解2,4-D主要通过两条代谢途径[13]：在α-酮戊二酸依赖型双加氧酶TfdA(来自富养产碱菌JMP134)或CadABC(来自短根瘤菌HW13)的作用下，催化2,4-D脱去乙酸基团生成毒性比2,4-D低100倍的2,4-二氯苯酚，随后2,4-二氯苯酚在羟化酶TfdB的催化下被转化为3,5-二氯邻苯二酚，随后在TfdCDEF的作用下开环，最终被降解为β-酮己二酸，进入三羧酸循环[14]；在圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)中，2,4-D在未知脱氯酶的作用下首先脱去一个氯原子生成对氯苯氧乙酸，随后氧化脱去乙酸基团生成对氯苯酚，进一步羟基化生成4-氯邻苯二酚，然后开环被降解为β-酮己二酸，最终进入三羧酸循环[15]。

表2 降解2,4-D的潜力微生物菌株

在植物中，2,4-D的代谢途径包括侧链裂解、环羟基化、共轭作用、结合生成植物生化基质[24]。侧链裂解是侧链经过氧化作用生成乙醇酸和二氯苯酚，同时导致二氧化碳含量减少。共轭反应主要是指2,4-D与氨基酸或葡萄糖的直接结合[25]。氨基酸(主要是谷氨酸和天冬氨酸)和葡萄糖可与2,4-D的羧酸基团直接结合，生成氨基酸轭合物或2,4-D葡萄糖酯。氨基酸轭合物是双子叶植物中形成的第一代谢产物，最初产生谷氨酸轭合物，但随着时间的推移，2,4-D-谷氨酸轭合物转化为其他代谢物，如2,4-D-天冬氨酸轭合物和糖轭合物，2,4-D-葡萄糖轭合物在葡糖基转移酶的作用下生成葡萄糖酯[26]。环羟基化则主要发生在抗性的单子叶植物。细胞色素P450酶参与了环羟基化，催化2,4-D代谢为4-羟基-2,5-二氯苯氧基乙酸和4-羟基-2,3-二氯苯氧基乙酸。羟基化后，葡萄糖基转移酶迅速催化环羟基化代谢物生成O-葡萄糖苷，接着代谢产物进一步和其他糖(包括丙二酸)形成更大的结构。环羟基化后的产物和2,4-D相比具有更强的亲水性和极性，同时也不像结合的产物一样能够水解还原成为2,4-D[27]。

3 2,4-D对生物体的危害及与环境的互作

除草剂能够通过直接接触、间接积累来影响生物产生逆境响应。很多研究已表明在除草剂喷施后生物体能够在非常短的时间内积累一个相当高的2,4-D浓度[28]。例如，在稻田水中检测到的2,4-D浓度超过300 μm·L-1，而在土壤中的含量高于0.17 mg·kg-1[29]。水体污染经常是由农药的过量喷施和漂移引起的。数十年的研究发现水生食物网在受到2,4-D污染后会将除草剂残留释放进入海洋环境并逐步在海洋环境中大量积累，最终通过动物的饲养进入人体[30]。

3.1 2,4-D对植物的危害

虽然使用化学除草剂是很有效的除草方法，但是非选择性的除草剂仍然会对植物造成伤害。2,4-D作为人工合成的类生长激素主要作用于生长激素受体TIR1或者它的类似物，增强生长激素响应基因的表达，特别是涉及乙烯和脱落酸合成的基因[31-32]。在敏感型双子叶或者靶标植物中，2,4-D引起的生理响应大致可以分为刺激、抑制和衰退3个阶段[32]。刺激阶段在几分钟内就开始发生，伴随内源生长激素浓度的迅猛上升，同时乙烯、脱落酸含量增加，离子通道和ATP酶代谢被激活，几小时后植物呈现出偏上性生长、组织膨大、茎扭曲等明显的异常症状。在抑制阶段，大量活性氧的产生导致气孔关闭，诱导生理防御和胁迫响应，减少氨基酸、糖类、核酸和其他初级代谢物等植物生长发育必需物质的总产量。这些大量不受控制的反应导致了生长停滞并最终走向衰退的阶段。大约3 d后，叶绿体、膜、维管束系统的崩溃使组织/细胞受到严重损伤最终导致植物死亡。虽然2,4-D选择性的防除阔叶类杂草，但由于它对植物的毒性已对很多敏感的阔叶类作物产生了危害。研究发现，棉花、大豆和葡萄等阔叶类作物，在极低浓度的2,4-D作用下就可造成严重减产。当葡萄叶子接触2,4-D，会对内部和外部的组织细胞产生严重的异常症状，保卫细胞失活，光合作用和蒸腾作用降低，最后导致植株死亡[33]。2,4-D接触过的棉花叶片和茎受损严重，产量和对照相比显著降低35%[34]。花生在2,4-D处理后的1～2周后，药害症状和除草剂浓度相关，浓度越高毒害越严重，产量也越低[35]。其他蔬菜作物对低剂量2,4-D的敏感性各异。

3.2 2,4-D对野生动物的危害

野生动物接触2,4-D，不管是直接喷洒还是摄入喷施过的植物都是低毒。现在研究证明，2,4-D对鱼类、两栖类(青蛙)实际无毒，对水生无脊柱动物仅有轻微毒性，对蜜蜂和蚯蚓实际无毒。但是Dehnert等[36]和Thiel等[37]发现，2,4-D会改变幼鱼视觉神经回路的发育和功能，影响成年斑马鱼线粒体的功能和氧化状态。2,4-D通过吸收、摄取或皮肤进入哺乳动物体内，毒性表现比较温和，LD50的范围是209 mg·kg-1(日本鹌鹑)～1 600 mg·kg-1(兔子)[38]。对昆虫(瓢虫)成虫来说，2,4-D虽然不会致死，但会影响幼虫的生育期和存活率，还能降低雄性比例[39]。

3.3 2,4-D对人类的危害

农业用地、商业和住宅绿地、高尔夫球场、公园、路旁等地都是人类可能通过吸入(灰尘/蒸汽)、非饮食摄入或者皮肤接触等方式接触2,4-D的潜在区域，同时被2,4-D污染的饮用水、土壤和食物则是接触2,4-D的主要途径。2,4-D污染的空气能够引起皮肤和肺部的刺激、发痒和灼烧感，直接摄入则会导致呕吐、头疼、腹泻、骨肌受损、高血压等[40]。人类可以通过尿液的排泄有效迅速地代谢2,4-D[41]。通常来说，成人和孩子尿液中的2,4-D含量低于3.5 ng·mL-1(美国和加拿大)[42-43]，然而职业工人喷施2,4-D前后尿液中的含量分别是7.8 μg·L-1和33 μg·L-1[44]。最近的流行病学研究表明，玉米地的农民在喷施2,4-D后尿液中的除草剂含量是对照组的5倍，并且2,4-D会引起DNA的损伤和脂蛋白的过氧化。这可能表明2,4-D诱导的氧化反应在癌症和其他慢性疾病的发病机理中起重要作用[45]。虽然很多哺乳动物的毒理学研究表明接触2,4-D能够引起动物和人类的不良反应，但是2,4-D诱导的毒性机理还不清楚。短时间的接触2,4-D会严重影响细胞功能，在分子水平上2,4-D阻碍细胞骨架和产生活性氧来影响肺中的细胞微管系统，导致呼吸困难、咳嗽、胸痛，最终形成肺气肿或者慢性的肺部疾病[40]。2,4-D还能和牛血清蛋白结合形成复合物，蛋白的内源荧光被猝灭，同时伴随着蛋白构象的改变[46]。另一个令人震惊的结果是2,4-D能够协同其他污染物质一起产生不良的诱变反应，例如它能够和其他污染物质一起作用于结肠腺癌细胞，产生更加严重的反应[47]。Sun等[48]发现，2,4-D通过调控过氧化物酶体增殖活化受体影响肝癌细胞的葡萄糖代谢，导致其代谢紊乱。

3.4 2,4-D和环境的互作

地表水中的除草剂最终会沉积到底渣中，可能对底栖生物产生影响。如果环境条件发生变化，吸附的除草剂可以释放回环境介质中。土壤是一种动态的生态系统，其中除草剂可以降解或改变位置，或者在原位保留完整的初始结构，或者在一定的时间段内或多或少地分解[49]。在稳定的环境条件下，除草剂会变得更具流动性和持久性，从而进入地下水循环系统。在小麦种植中，2,4-D表现出更高深度的渗透率，这归因于土壤中水含量较高，同时2,4-D具有水溶性和对土壤颗粒的低吸附性。土壤中2,4-D的轨迹受多种复杂的动态物理、化学和生物过程控制，包括挥发、吸附-解吸、化学和生物降解、植物吸收、径流和淋溶[50]。所有这些过程都取决于2,4-D的物理化学性质、环境条件、微生物和土壤性质。这些因素直接控制土壤溶液中2,4-D的浓度、迁移、土壤耗散、淋溶及植物对其的生物利用度。另外，2,4-D作为弱酸会失去质子，因此，它主要作为阴离子存在土壤(pH 5～8)中。通常，阴离子很难被土壤表面吸附。2,4-D与土壤的结合能力很弱，并且与土壤pH值升高呈负相关。2,4-D吸附随着土壤有机质的增加而增加，如果土壤中黏土或有机质含量低，则淋溶是2,4-D脱靶运动的主要来源。在灌溉条件下，浅层土壤的地下水中2,4-D含量较高。

4 2,4-D的使用现状

2,4-D在全球范围内被广泛用于控制小粒谷物、水果、坚果、蔬菜、作物、牧场、草坪、道路、水域和林区中的阔叶类杂草和木本植物。目前在美国登记的2,4-D产品和2,4-D混剂都超过50种。在1945—1959年，2,4-D的产量从41.6万kg上升到了635万kg[51]。随着新型选择性除草剂的开发，2,4-D在美国主要作物上的用量从1966年的1 810万kg(占除草剂用量的34%)，下降为1971年的1 540万kg(占除草剂用量的15%)[52]。然而1960—1971年，2,4-D占小麦田农药用量的大半，甚至在20世纪90年代初期，仍有40%～60%的春小麦和硬粒小麦、15%～20%的冬小麦、10%的玉米、9%的高粱在种植过程中使用2,4-D。截至2012年，13%的冬小麦2,4-D的平均用量为600 g·hm-2，有效成分总计近110万kg[41]。国内生产的2,4-D产品主要是丁酯类，2012年我国含2,4-D丁酯成分除草剂的年生产量26 117 t，国内销售20 841 t，农业生产使用19 887 t。根据农业部农药检定所统计，我国已有6家企业登记原药，43家企业登记单剂，122家企业登记复配剂。剂型有乳油、悬浮剂、水悬浮剂、可分散油悬浮剂等，按有效成分计算，年生产量近3万t，待开发的转基因耐除草剂的应用，2,4-D丁酯也是主要品种，应用非常广泛。

另一方面，由于2,4-D拥有类似自然激素的特性，低浓度的2,4-D也可以作为生长调节剂增加细胞分裂和伸长，提高植物长势。2,4-D能够使细胞黏弹性发生变化，影响细胞内物质运输速度[53]。2 mg·L-1的2,4-D可以加快球花红假单胞菌的生长和脂肪积累[54]。2,4-D通过诱导赤霉素合成来促进梨的单性结实[55]。在组织培养中，2,4-D能代替生长素(IAA)作为植物细胞培养基中正常细胞生长发育的激素补充。但Passamani等[56]和Reis等[57]发现，长期使用2,4-D会降低甘蔗胚性愈伤组织的胚性能力。2,4-D还能作为一种强力的水稻防御诱导因子。食草动物取食植物会激发各种激素包括茉莉酸、水杨酸、乙烯的防御响应。而2,4-D显著诱导茉莉酸和乙烯的上游通路的防御反应，增强胰蛋白酶抑制剂的活性和挥发性物质的产生。在田间试验中，水稻喷施2,4-D能吸引褐飞虱和它的卵寄生物种稻虱缨小蜂[58]。2,4-D通过调节抗氧化防御的酶活性降低氧化胁迫，提高单子叶植物对盐害逆境耐受能力[59]。

5 杂草对2,4-D的抗性

2,4-D自1946年商业化投入使用以来，凭借着高效的除草能力和低廉的成本至今仍是世界范围内使用最广泛的除草剂之一，目前市场上有超过600种的2,4-D产品。由于使用时间太久、喷施量太大导致杂草对其产生了不同程度的抗性。尽管2,4-D的使用历史超过70 a，它在靶标杂草中对除草剂抗性演变的影响仍然有限。目前已报道31种杂草具有抗生长激素型除草剂的生物型，而仅使用30 a的乙酰乳酸合酶(ALS)抑制类除草剂产生了158种抗性杂草[60]。但是随着北美转基因抗2,4-D作物的商业化种植，抗性杂草的种类可能会迅速增加，同时加快抗性杂草的进化速度[61]。

5.1 双子叶杂草对2,4-D的抗性

到目前为止，已经有40例杂草对生长激素类除草剂产生抗性的报道，其中有25例对2,4-D有抗性，包括仅对2,4-D有抗性的12例和对其他生长激素型除草剂也有抗性的13例[62]。这25例中有22例涉及双子叶杂草，其中野萝卜(Raphanusraphanistrum)、野胡萝卜(Daucuscarota)、黄花蔺(Limnocarisflava)、虞美人(Papaverrhoeas)和尖瓣花(Sphenocleazeylanica)以及两种飞廉属(Carduus)杂草等具有多个抗性案例[62]。自2011年Mithila[63]等人报道了激素类除草剂抗性之后，最新发现的糙果苋(Amaranthustuberculatus)[64]、野萝卜的其他几个种群[65-66]、播娘蒿(Descurainiasophia)以及一年生苦苣菜(Sonchrusoleraceus)种群等对2,4-D类似物苯氧乙酸类除草剂2甲4氯(MCPA)具有抗性。最近的遗传研究探明西澳大利亚洲野萝卜对MCPA的抗性受单一不完全显性基因的控制[67]。

5.2 抗性的机理

Transport Inhibitor Response 1(TIR1)和Auxin F-Box(AFB)是激素类除草剂中2个最重要的靶标位点[68]。之前的基因组学和蛋白免疫沉淀实验的结果显示，内源激素IAA能够激活TIR1或者它的底物Aux/IAA蛋白[69]。Dharmasiri等[70]研究发现，F-box蛋白在配体结合中起到关键作用。而随后的蛋白晶体结构学又显示被激活的TIR1复合体是受体结合的一种新的形式，像一种“分子胶”，同时参与底物的结合来形成早期的识别口袋。虽然晶体结构学显示起主要作用的是激素和TIR1的结合，但是TIR1以及它的底物Aux/IAA蛋白在配体结合中都是不可或缺的[71]。在拟南芥中，TIR1家族有AFB1、AFB2、AFB3、AFB4和AFB5这5个同源蛋白。其中，AFB4、AFB5均为除草剂毒莠定的作用受体，这5个蛋白共同作用，调控生长素反应[72]。最近的研究表明，拟南芥中TIR1辅助受体富含亮氨酸的重复结构域中2个不同氨基酸的突变增加了对IAA的结合亲和力，导致了Aux/IAA转录抑制子的降解加快和生长素响应基因的转录增加[73]。这些突变被认为是造成典型的生长素超敏症状的原因。另外，2个TIR1的突变是加性效应，使得双突变的TIR1蛋白比单一突变具有更高的亲和力[74]，这与毒秀定和AFB结合不同。这些结果表明拟南芥或其他双子叶植物的TIR1/AFB蛋白修饰，可增加或降低这些蛋白对2,4-D或其他合成类除草剂的结合力，导致植物出现生长素超敏反应或者脱敏反应[75]。除此之外，发生在Aux/IAA转录抑制子蛋白的突变也会影响其与生长素受体TIR1/AFB家族的结合与相互作用[73]。

除去靶标位点可能产生的突变，另一种可能就是细胞色素P450s或者谷胱甘肽S转移酶(GSTs)等产生的非靶标抗性，包括除草剂代谢增强、运输减少[76]。例如，抗性的野莴苣和敏感的品种相比，2,4-D的代谢速率没有差异，但是吸收和运输显著上升[77]。这可能是由于除草剂代谢第3阶段的运输和解毒能力，极性代谢物和除草剂的结合物在液泡中永久被固定[78]。

6 展望

2,4-D从开发到如今已经超过70 a，一直作为各种作物和非作物用途中的杂草防除工具。对2,4-D化学、生理、作用机制、环境行为等方面的研究不仅有助于阐明其自身的特性，为除草剂作用机制和生理学研究奠定基础，还对其后新颖除草剂的研发具有重要的借鉴意义。近年来，随着对分子水平作用机制的深入研究，借助生物技术手段发展了2,4-D的新用途，延长了使用寿命，使其能更好地继续为人类生产和生活服务。