王哲， 吴诗涵， 索金伟， 吴家胜

(浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300)

香榧是红豆杉科榧树属雌雄异株的常绿乔木，是经过无性繁殖选育出的产量高、风味好的优良栽培品种[1]。香榧属于裸子植物门，没有真正的果实，但由于其种实在形态上呈核果状，一般将其划为坚果，称为种实。相对于其他的榧树类型，香榧种实的种仁(包含胚和胚乳)含有丰富的油脂、蛋白质、维生素等营养物质，香脆可口，具有很高的保健、药用和综合开发利用价值[2-3]。香榧种实具有绿色肉质假种皮，上有纵棱纹，外有白粉；种实呈长圆形或橄榄形，基部有宿存的苞鳞和珠鳞，顶部有凸起的短尖头。假种皮内是骨质种皮、红色膜质内种皮(俗称种衣)，胚乳具有褶皱，呈乳白色至乳黄色[4]。

香榧种实发育成熟经历时间长，从授粉到种实成熟需要跨年历时17个月，当年4月开花授粉后至翌年9月采收前，树上可同时看到大小2种种实(小的是当年授粉的种实，大的是去年授粉的种实)，即所谓“二代果”现象[5]。香榧种实生长发育大致可分为以下几个时期：当年4月中旬左右进行开花授粉，授粉后幼果包裹于苞鳞和珠鳞中，并于当年9—10月完成受精，原胚形成[6-7]。此后，幼果一直包裹于苞鳞和珠鳞中越冬，体积没有明显增长，外观和质量上几无变化。直到翌年4月初，种实开始启动细胞分裂和膨大，逐渐从种鳞中突破出来；5月初幼果开始进入旺盛的生长期，含水率开始上升，种实体积明显增大，种实内干物质的积累也加快。在快速生长初期，种仁(包含胚和胚乳)呈液体状，到6月中旬种仁呈凝胶状并逐渐硬化；7月初至9月初是种实内部充实阶段，此时种实的体积不再有明显变化，淀粉逐渐降解，油脂含量不断升高。9月初至秋分之间种实成熟，假种皮由绿色转为黄绿色或淡黄色，有的假种皮开裂，少量种实落地，此时便是采收时期[8]。人们长期观察发现，香榧种实在发育初期会有大量种实无法突破种鳞而停止生长，但仍宿存在结果枝上，这类种实称为“僵果”。据调查，部分香榧林分僵果率高达95%，严重制约香榧产量，是当前香榧产业发展的关键瓶颈因素，因此，对香榧僵果的研究十分重要。对于香榧僵果的调查和研究还未见报道，完善的观察是研究香榧僵果发生原因、提高香榧产量的重要前提。对香榧僵果的调查和解剖学观察可以为香榧种实发育研究提供参考，对促进香榧产业持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

于浙江省杭州市临安区浙江农林大学香榧种植基地随机选取5株长势良好的香榧作为观测对象。试验地为土质疏松、排水良好的山坡地，基地采用统一的田间施肥管理，3月中旬施入速效肥，9月中旬采果以后施用化肥和有机肥。

1.2 方法

1.2.1 香榧种实发育及僵果率调查

从2018年4月一年生枝上的营养芽抽梢、混合芽开花开始到9月采收结束，每3～5 d观察香榧种实生长发育变化，记录僵果发生情况。

1.2.2 败育香榧的组织切片观察

采集授粉后一年生和二年生枝条上的香榧僵果各6对，按照常规石蜡制片法制片，观察胚珠结构。具体方法如下。

固定。将香榧种实浸没于FAA固定液中固定24 h。

脱水。固定好的香榧材料取出后用70%乙醇稍加冲洗，再依次用50%、70%、85%、95%、100%浓度梯度的乙醇浸没，100%乙醇重复2次，以完全置换掉组织内的水分，每级1 h。

透明。将脱水的材料依次用不同比例的乙醇、二甲苯溶液(2∶3、1∶1、1∶2)浸没，再用纯二甲苯浸没2次，每级1.5 h，使组织中乙醇完全被二甲苯替代从而透明。

浸蜡。将材料取出，转入到带刻度的50 mL离心管，从不同比例的二甲苯和石蜡的溶液逐步过渡到纯蜡，使材料中的二甲苯完全被石蜡置换。

包埋。将熔化的纯蜡倒入小纸盒中，将小纸盒置于冰水上，再将材料放入小纸盒，使用加热过的镊子调整材料位置，待小纸盒中的石蜡表面凝固后压入水中冷却。

修蜡。将蜡块中材料周边的蜡修整为长方体，材料隐约可见。

切片。将材料置于Leica RM2235全自动切片机蜡座上，切出蜡带，切片厚度7～8 μm。

黏片。在干净的载玻片上加入1%明胶1滴并涂匀，加入数滴展片剂(2%～4%甲醛溶液)，将材料截断后平置于载玻片上，将载玻片置于42 ℃烤片机上烘烤，2 min后用吸水纸吸干水分，再烘烤2 min，装入切片盒中。染色前烘箱37 ℃继续烘烤1～2 d。

脱蜡。按100%二甲苯1→100%二甲苯2→1/2二甲苯+1/2乙醇→100%乙醇1→100%乙醇2→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→50%乙醇→35%乙醇→蒸馏水的顺序依次浸没，每级5 min。

染色。采用番红与固绿色法。番红用1%的水溶液，固绿用0.5%的乙醇液，番红染色时间2～4 h，固绿染色时间为20 s。

1.2.3 香榧僵果发生的位置效应

随机选取247根香榧一年生枝条，将枝条分为上、中、下3段，从最靠近主枝的对果位置开始，依次编为1～11号，统计不同位置形成不同类型对果的频率，计数不同类型对果数目。随机选取香榧二年生枝条，按其在树体上所处位置的高度分为上、下二类枝条，按树体朝向分为东、南、西、北四类枝条，按僵果数与幼果总数之比统计僵果率。

2 结果与分析

2.1 香榧种实败育的观察

在香榧种实发育过程中，僵果始于授粉后翌年的4月下旬，在部分种实迅速膨大的同时，部分种实停止生长，在体积上有明显差异。僵果主要发生在种鳞裂开时期和胚珠突破初期，有些僵果的种鳞不会裂开，有些僵果的种鳞裂开，但胚珠的高度不会超过种鳞。香榧僵果按照对果的数目可分为双膨果、单僵果和双僵果3类，僵果数目依次为0、1、2，具体见图1。

图1 一年生枝条和二年生枝条上的双僵果、单僵果和双膨果

2.2 香榧雌花和种实发育阶段败育的组织观察

如图2所示，香榧僵果自4月初开始，其幼果珠心组织萎缩，同时僵果细胞显示出更多的红色，表明木质化程度更高。5月初正常发育种实的胚乳发育良好，体积增大，胚乳细胞丰富饱满；而僵果无胚乳分化，萎蔫，内部组织降解。

图2 一年生枝条和二年生枝条上僵果结构

2.3 香榧种实败育的位置效应

不同类型对果在枝条上的分布如表1所示。在247根一年生枝条上，共有双膨果158对，单僵果753对，双僵果690对，比例分别是10%、47%、43%。在1号位置上，双膨果、单僵果和双僵果的数目依次为44、118、85，频率依次为0.178、0.478、0.433。从每对果的位置来看，2号位置的双膨果数目最少，双僵果数目最多；从对果在枝条上的位置来看，枝条下端的双僵果数目最多。

表1 一年生枝条上香榧不同类型对果的分布情况

不同方位和不同单株二年生枝条上僵果率情况如表2所示，统计幼果总数5 571个，各方向至少统计1 200颗，平均僵果率为89%，朝南的僵果率最低，下方僵果率比上方低。

表2 不同方位二年生枝条上香榧僵果率

3 小结与讨论

种实败育是植物普遍存在的一种现象，导致败育的因素包括授粉受精不良，营养缺乏，环境胁迫等[9]。授粉期的珠心败育是授粉不良导致的，目前通过人工授粉已经可以显著提高香榧授粉期的挂果数量[10]。香榧种实败育(僵果)主要发生在幼果开始膨大时，此时僵果率很高。本次观察到的僵果率达89%，对香榧产量有很大影响，同时也表明香榧还有很大的增产空间。已有田间试验发现，通过在香榧花期和幼果期喷施提高细胞活性的植物生长调节剂能有效提高香榧产量[11]，但是幼果期具体的调节机制还有待进一步研究。

通过对香榧僵果发生的位置调查发现，位于枝条下端(基端)的对果容易发生双僵果，上端的对果主要发生单个僵果；朝南方的僵果率最低，树体下方僵果率比上方低，但总体上差异不显著，位置效应不明显。有研究发现，光照是气候因子中影响香榧产量的主要因素[12]，同时光合同化物对于植物种实的正常发育至关重要[13]。因此，枝条下端(基端)对果双僵果更多发生可能是由于遮挡导致的光照相对不足，朝南方向枝条上僵果率较低可能是朝南方向光照更充足所致。