安 鑫 汪之和*

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

贝类产量是我国渔业资源中仅次于鱼类的第二大水产资源，根据《中国渔业年鉴》[1]统计：2019 年我国贝类养殖产量约1458 万吨，捕捞量约62 万吨。目前贝类的利用仅限于肉质部分，按贝壳占比60%计算[2]，2019 年产生约912 万吨贝壳，大多数贝壳资源未能得到有效利用，并在一定程度上造成对环境的污染[3]。废弃贝壳的积累已成为真正的环境问题，特别是在贝类养殖区或沿海地带。这些贝壳通常有肉质残留，在自然条件下，这些有机物会被微生物分解，释放出有毒有害的氨、硫化氢和烃类气体[3]。废弃贝壳的堆积也会造成沿海水域污染加剧、生态环境恶化、生物资源减少等问题。

为了减少贝壳资源的浪费，已有许多学者将贝壳作为抗菌剂进行相关研究。比如将贝壳经过高温煅烧后制得活性氧化钙，比较不同贝壳煅烧产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的杀菌作用[4]。还有海洋贝壳提取物对霉菌和酵母菌的抑制作用，使其在食物的保鲜以及防腐也有着重要的应用。煅烧贝壳活性钙已经在美国和日本被允许作为食品添加剂，Young[5]等人研究了添加牡蛎壳对豆腐品质和货架期的影响，豆腐的口感好，硬度适中，并且保质期比使用氯化镁的豆腐延长2 天以上。这种活性氧化钙使得煅烧贝壳粉不仅对常见致病菌有杀菌和抑菌作用，而且在黑曲霉等霉菌的抑制上也有良好的作用。在日本建筑业，主要是通过在涂料中添加煅烧牡蛎壳粉防止墙面发霉[6]。煅烧贝壳粉还可增强其他材料抗菌性能，提高复合材料的抑菌效果[7-9]。

本文利用高温煅烧贝壳粉为抑菌剂, 选择最具代表性的金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌做供试菌，研究贝壳粉对两种致病菌的抗菌性能和杀菌作用，以及抑菌圈试验。同时测定贝壳粉的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度；同时以黑曲霉菌为供试菌测定贝壳粉防霉性能，为高温煅烧贝壳粉作为抗菌剂应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

材料：太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）购于上海市芦潮港生鲜市场；供试菌株：大肠杆菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、黑曲霉菌（ATCC16404）均取自上海海洋大学微生物实验室，由国家级菌种保藏机构提供。

试剂：营养琼脂、营养肉汤（NB）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基均为北京双旋微生物培育制品厂生产；无菌水；氧化钙，分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

QL-861 型旋涡混合器：海门市麒麟医用仪器厂；JY-150B超声波破碎仪：北京天恩瀚拓科技有限公司；ZWY 全温型摇床：常州金坛娘友公司；S2 pH 计：上海梅特勒- 托利多仪器有限公司；SW-CJ-1F 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器：上海申安医疗器械厂；UV-2000 型紫外分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；ALC-110，ACCULAB 型电子天平：巩义市予华仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煅烧贝壳粉的制备

贝壳预处理: 水煮贝壳直到开口，去除内脏和闭壳肌，浸泡24h 后将表面处理干净。在自然光照下晾干2d 后，用去离子水清洗，并破碎成0.3cm 左右小块。并置于稀醋酸溶液浸泡2h，再用去离子水清洗，将贝壳置入烘箱70℃恒温烘干20h，冷却后粉碎，过100 目筛，得到100μm 左右的贝壳粉[10]。

将贝壳粉末置于1100℃的温度下进行煅烧处理，称取适量粉碎好的贝壳粉坩埚中，设置温度1100 ℃，煅烧时间为2 h，冷却煅烧后的样品均保存在密闭容器中，以避免使用前与二氧化碳和空气中的水分发生反应。

1.2.2 煅烧贝壳粉悬浊液的制备

参考GB/T 21510-2008 纳米无机材料抗菌性能检测方法[11]，用生理盐水配制浓度为0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的高温煅烧贝壳粉悬浊液。为了保证粉末在液体中分散均匀，采用超声波分散3min，保证全部分散成均匀悬浊液。

1.2.3 试验菌种活化及菌悬液的制备

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：参考GB/T21510-2008 纳米无机材料抗菌性能检测方法[11]，对供试菌种进行活化分离、纯化，在37℃培养24h 得到第三代培养物。取活化后的第三代培养物稀释成浓度为105cfu/mL 的菌悬液。

黑曲霉菌：在无菌操作台上将霉菌孢子接种在PDA 培养基斜面上，28℃培养至斜面长满黑色霉菌孢子。取10 mL 无菌水倒入PDA 培养基斜面，用无菌接种环轻刮菌种表面洗出孢子，并倒入含玻璃珠的无菌水中，振荡使孢子团分散，并用无菌快速定性滤纸过滤，除去菌丝碎片、琼脂块和孢子团。4000 rpm 离心，收集孢子沉淀并用50 mL 无菌水清洗，再次离心并收集沉淀，洗涤3 次，最后用无菌无机盐营养液稀释，用血细胞计数板计数，使孢子液中孢子含量为1×106个/mL～5×106个/mL。

1.2.4 煅烧贝壳粉抑菌性能测定

将5mL 菌悬液添加至95mL 制备好的贝壳粉悬浊液（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%），置于恒温37℃振荡器中振荡培养，选用分析纯微米尺度二氧化硅粉末作为对照组，振荡时间为24 小时，进行平板法菌落计数。

根据公式计算试验菌的增长值F。对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌等细菌，当F≥1.5，且对照烧瓶中的活菌浓度比接种时的活菌浓度增加时，试验判定为有效。否则试验无效，需重新进行试验。

F=lgWt-lgW0

式中：

F：对照样的试验菌增长值;

Wt：对照样24h 振荡接触后烧瓶内的活菌浓度的平均值(cfu/mL);

W0：对照样“0”接触时间烧瓶内的活菌浓度的平均值(cfu/mL)。

1.2.5 煅烧贝壳粉杀菌作用时间研究

测定1.0%含量的贝壳粉悬液不同作用时间，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率。细菌初始浓度配制为108cfu/mL，作用时保持振荡，使贝壳粉一直悬浮均匀，振荡时间（作用时间）分别为0、10、20 及30 min，对照组选用分析纯微米尺度二氧化硅粉末，杀菌温度为26℃[11]。

1.2.6 滤纸片法测定煅烧贝壳粉抑菌作用

选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为测试菌种，将载有样品的滤纸片置于涂有菌液的琼脂培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24 小时，测量抑菌圈的宽度[12]。抑菌带宽度(H)的计算如式所示：

H=(D-d)/2

其中：D 为抑菌带外径的平均值(mm)；d 为样品的直径(mm)。

图1 抑菌带宽度计算示意图

用移液枪分别吸取无菌水、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%及1.0%三种混悬液各20μL 注入到对应的小圆片的正中央，自然晾干待用。滤纸片仅一侧滴加样品，摇晃悬液，使悬液均匀。在37℃培养箱中倒置培养24 小时，用游标卡尺测量抑菌圈尺寸。

1.2.7 最小抑菌浓度的测定（MIC）

采用生理盐水配制浓度为1.0%的贝壳粉悬液，并进行系列对倍稀释，混匀待用；含抗菌剂培养液配制：分别取各稀释度样品2.5 mL 和营养肉汤培养液2.5 mL 于洁净的试管内，阳性对照组用2.5 mL 的生理盐水代替样品[12]。所有试管加液完后蒸汽灭菌。待冷却至室温，用超声波分散3 min，添加0.1 mL 菌悬液并晃动均匀。将整个试管架置于恒温振荡箱中，37℃振荡24h，转速200 rpm。24h 后对所有试管的浑浊度进行比对，判定其MIC。

1.2.8 最小杀菌浓度的测定（MBC）

在最小抑菌浓度的基础上，选择培养液开始浑浊周围几个稀释度，进一步对培养后的培养液进行活菌计数，得出最小杀菌浓度。方法同MIC 的测定，在超净台内，用无菌移液枪各吸取1 mL 上述筛选出的样本于无菌平皿内，并注入25 mL 营养琼脂培养基摇晃均匀，待其自然凝固，将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h。观察培养24h 后的平皿中细菌生长情况，比对菌落数量，判定其MBC。

1.2.9 煅烧贝壳粉对黑曲霉的抑制研究

杀霉率测定：采用1%的贝壳粉准确称取1.00g 样品（贝壳粉）和对照（微米级二氧化硅粉）于干燥洁净的250 mL 锥形瓶中。用生理盐水配置培养液，沙氏液体培养基的含量为正常沙氏液体培养基溶液的五百分之一。在恒温振荡箱中振荡12 h（调节温度为28℃，转速150 rpm），振荡后的培养液进行10 倍梯度系列稀释，从每个稀释倍数的液体中分别吸取0.1 mL，加入准备好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 平板中，用无菌玻璃推棒涂布均匀。平皿倒置于37℃培养箱中培养24h，对平皿中霉菌菌落数进行计数，计算杀霉率[13]。

防霉性能的测定：采用1.0%贝壳粉悬浮液测定其对黑曲霉的防霉性能，采用经验证不具有防霉性能的微米级二氧化硅粉作为对照。接种后，将平板置于28℃（相对湿度90%±5%）的条件下培养28 天[13，14]。防霉效果评价见表1。

表1 防霉效果评价[13]

2 结果与分析

2.1 不同浓度高温煅烧贝壳粉悬浊液对两种细菌的抑菌效果

表2 为不同浓度贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。由表2 可知，随着高温煅烧贝壳粉悬浊液浓度增加，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果增大。当浓度达到0.05%时，高温煅烧贝壳粉悬液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于99.99%，表现出优异的抑菌性能。然而，0.01%的高温煅烧贝壳粉悬液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为92.50%和47.33%，结果表明其对大肠杆菌具有明显的抑菌性能，而对金黄色葡萄球菌几乎不具有抑菌性能。同时表明低浓度的贝壳粉悬液，抗大肠杆菌性能比抗金黄色葡萄球菌性能好。

表2 不同浓度贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果

2.2 作用时间对两种细菌的杀菌效果

表3 为1%浓度贝壳粉悬浊液作用时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果。由表3 可知，1.0%的贝壳粉悬液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用0min 的杀菌率分别为5.56%和34.29%；随着时间延长，5min 后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为99.99%和99.50%。表明1.0%的贝壳粉悬液对菌浓度在108cfu/mL 数量级的大肠杆菌作用5 min 后，即可几乎全部杀灭。10min 之后培养液中的两种几乎全部被杀灭（杀菌率大于99.99%）。说明1.0%的贝壳粉悬液对菌浓度在108cfu/mL 数量级的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用仅10 min 即可几乎全部杀灭，具有优异的杀菌性能。

表3 1%浓度贝壳粉悬浊液作用时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果

2.3 滤纸片法分析

表4 为高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌滤纸片法抑菌效果。由表4 可知，对照组滤纸样品周围长满大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，无抑菌圈产生，相比对照组，所有负载不同浓度贝壳粉的滤纸片均产生了抑菌环，相同样品对金黄色葡萄球菌的抑菌环宽度比大肠杆菌的抑菌环宽度大，并且随着高温煅烧贝壳粉悬液浓度的增加，抑菌环宽度也在增加。表明负载贝壳粉的滤纸片中的贝壳粉可以通过扩散作用扩散至培养基中，抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长，形成抑菌环。

表4 高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌滤纸片法抑菌效果

2.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的确定

高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）如表5 所示，阴性对照未出现浑浊现象，大肠杆菌阳性对照组及金黄色葡萄球菌阳性对照组均变浑浊。高温煅烧贝壳粉浓度在313 ppm 以上时，试管均未出现浑浊现象，当样品浓度小于等于250 ppm 时，试管中的培养液变浑浊，且浑浊度随着浓度降低而增加。可确定高温煅烧贝壳粉样品时对大肠杆菌（和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）均为313 ppm。

表5 高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）

表6 为高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）。由表6 可知，阴性对照未出现浑浊现象，大肠杆菌阳性对照组及金黄色葡萄球菌阳性对照组均变浑浊，进行细菌计数时发现阳性对照基本满板生长。高温煅烧贝壳浓度在250 ppm 及其以下时，平板中细菌多不可计；样品浓度为313 ppm 时，平板中有少量细菌生长；样品浓度为500 ppm 时，金黄色葡萄球菌仅4 个菌落生长，大肠杆菌仅3 个菌落生长；当浓度在625 ppm 及其以上时，平板中均无细菌生长。以上结果与高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为313 ppm 也是一致的。综上，确定高温煅烧贝壳粉样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）均为500 ppm。

表6 高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）

2.5 高温煅烧贝壳粉对黑曲霉菌抑制效果

表7 为霉菌生长平板图。由表7 可知，对照组培养基表面黑曲霉菌丝及黑曲霉孢子覆盖面积大于60%，阳性对照培养基表面有大量黑曲霉菌丝及黑曲霉孢子生长。阴性对照培养基表面无黑曲霉菌丝及黑曲霉孢子生长，对照样培养基表面存在大量黑曲霉菌丝及黑曲霉孢子，试验样培养基表面无黑曲霉菌丝及黑曲霉孢子生长，判定1.0%贝壳粉对黑曲霉的防霉等级为0级。为探究高温煅烧贝壳粉的杀霉率，表9 结果表明，振荡培养12 h 后，通过在PDA 培养基平皿中菌落计数，对照组培养液中活菌数为2.7×104个/mL，实验组培养液中活菌数为10 个/mL，对黑曲霉的杀灭率为99.96%。

表7 霉菌生长平板图

表8 高温煅烧贝壳粉对黑曲霉抑制性能评价

3 结论

3.1 通过研究牡蛎壳所制备的高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力和杀菌效果，结果表明，0.05%的高温煅烧贝壳粉悬浊液对两种致病菌的抑制率达到99%以上，0.01%的高温煅烧贝壳粉对大肠杆菌的抑制效果比金黄色葡萄球菌的抑制效果好。1.0%浓度的贝壳粉作用5min 即可杀灭99%的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。随着悬浊液浓度的增加，对两种致病菌的抑菌圈宽度增大，1.0%悬液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌环宽度分别为0.40 mm 和0.85 mm。这些结果表明，低浓度的高温贝壳粉悬浊液具有一定的杀菌和抑菌作用，其抑菌机理还需进一步探究[15]。

3.2 1.0%含量的贝壳粉与无机盐琼脂培养基所形成的混合物对黑曲霉的防霉等级为0 级，具有优异的防霉性能。1.0%含量的贝壳粉对黑曲霉孢子作用12 h 的杀灭率达到99.96%，具有优异的杀霉性能。