张孟玲 程晔 金菊

肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的80%～85%以上，而肺腺癌占NSCLC的40%～50%[1]。根据病理类型以及分子表型确定肺癌亚组，是目前肺癌临床个体化治疗的决定性因素[2]。70%的肺癌发现时已处于中晚期，仅能通过细针穿刺（fine-needle aspiration,FNA）或胸水等获取小组织或少量细胞进行检测，进而明确病理类型和分子表型。间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）为肺癌的驱动基因之一，若肿瘤细胞中存在ALK融合基因表达，称之为ALK阳性NSCLC，其是NSCLC的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK-酪氨酸激酶抑制剂（ALK-TKI）治疗中获益[3-4]。有研究指出，对于晚期NSCLC、腺癌或含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行ALK融合基因和表皮生长因子受体基因突变检测[5]。然而，40%的进展期NSCLC常不具备活检组织，仅可进行细胞学诊断。收集、浓缩细胞学样本制成细胞蜡块，能最大限度保留残留的组织结构。本研究旨在分析检测NSCLC患者细胞学样本ALK水平的临床意义，以便为临床肿瘤治疗提供重要依据。

1 对象和方法

1.1 对象 回顾性分析2016年1月至2020年12月在中国科学院大学附属肿瘤医院行ALK检测的NSCLC患者254例，其中男138例，女116例；年龄37～87（62.5±1.06）岁；细胞学样本类型：胸水样本 144例，FNA样本110例（包括锁骨上淋巴结70例、肺部肿块21例、经支气管镜活检和超声内镜引导下的经支气管针吸活检标本19例）；上述细胞学样本中同时具有小活检组织样本者43例。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法 胸水样本经离心、沉降后制作液基细胞学涂片2张，FNA样本经常规制作细胞学涂片2张；后将每例剩余细胞学样本经离心制作成细胞蜡块并制作石蜡切片（4 μm）；将小活检组织样本常规制作石蜡切片（4 μm）。细胞学涂片予巴氏染色，石蜡切片予常规HE染色，由高年资病理诊断医师进行阳性评估并确定为NSCLC后，在自动染色机（瑞士Roche公司）上进行ALK（克隆号：D5F3）免疫组化染色，并采用荧光原位杂交试剂盒（人类ALK基因融合检测探针，武汉康录生物技术股份有限公司）在全自动玻片处理系统（型号：LBP-6612，广州安必平医药科技公司）中进行荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization,FISH）检测。

1.3 免疫组化结果判读 肿瘤细胞中可见强的颗粒状细胞质染色信号即为ALK阳性表达。应排除已知染色伪影，如肺泡巨噬细胞中较淡的胞质染色、神经起源细胞（神经与神经节细胞）染色、腺上皮染色及浸润的淋巴细胞染色。正常NSCLC黏膜（包括黏蛋白）与坏死的肿瘤区域内见到的一些背景染色也应排除。

2 结果

254例样本均顺利完成ALK免疫组化染色，其中ALK阳性19例，阳性检出率为7.48%。胸水样本ALK阳性检出率为2.78%（4/144），FNA样本ALK阳性检出率为13.64%（15/110）。43例同时有细胞学样本和组织学样本的患者中，有5例两种样本中免疫组化染色ALK均为阳性（图1）。在细胞学样本中，有2例免疫组化染色ALK阳性者同时行FISH检测，结果显示ALK基因重排阳性（图2）。7例ALK免疫组化染色阳性患者已进行ALK-TKI治疗，其中接受治疗2个月以上者6例，随访1年后，达到部分缓解4例，完全缓解2例。

图1 1例非小细胞肺癌（NSCLC）患者细胞蜡块和活检组织样本间变性淋巴瘤激酶（ALK）检测所见[a：细胞蜡块HE染色，×10；b：活检组织HE染色，×10；c：细胞蜡块免疫组化染色，×10；d：活检组织免疫组化染色，×10]

图2 1例非小细胞肺癌（NSCLC）患者细胞蜡块间变性淋巴瘤激酶（ALK）检测所见[a：细胞蜡块HE染色，×10；b：细胞蜡块免疫组化染色，×10；c：细胞蜡块荧光原位杂交（FISH），×100]

3 讨论

组织病理学诊断是诊断肿瘤的金标准，但晚期肺癌患者通常无法获得手术标本，而细胞学样本则具有来源丰富，取样简单、快速、方便等特点。细胞学样本经离心后制作成细胞蜡块石蜡切片，其具有组织学形态结构，与传统巴氏涂片联合使用，可提高检测的灵敏度和特异度，且在行免疫组化和分子检测时，效果明显优于传统巴氏涂片[6]。在肿瘤细胞量足够的情况下制作细胞蜡块石蜡切片，可显示ALK阳性肺腺癌的一些形态学特征，如筛孔状结构、明显的核仁和细胞外黏液等，结合临床特征，对于筛选潜在ALK阳性率较高的肺腺癌患者可有所帮助[7]。在实际工作中，制作细胞蜡块前需进行样本评估，通常浆膜腔积液、FNA及细胞量丰富的超声引导下穿刺样本为较优检测标本。浆膜腔积液样本送检量建议在100 ml以上，如若临床可提取量较少，则应全部送检，重复送检可在一定程度上提高阳性检出率。本研究中，254例样本均完成ALK免疫组化检测，且细胞蜡块与活检组织两种样本中的检测结果具有一致性。这说明采用细胞学样本进行ALK检测，其结果真实可靠，可作为辅助诊断的良好平台。目前，细胞学样本ALK免疫组化检测结果的判读主要参照组织学样本ALK检测判读标准，对细胞蜡块中的成团细胞进行判读，如果成团细胞个数≥5即可判读为阳性[8]。

免疫组化、FISH和基于序列特异性的PCR检测均可作为ALK阳性NSCLC的诊断技术[9]。在利用细胞蜡块检测ALK时，必须含有足够多的肿瘤细胞，FISH检测中要求最少含有50个肿瘤细胞，免疫组化则没有明确定义[10]。本研究中，细胞蜡块免疫组化ALK阳性患者进一步行FISH检测，结果显示ALK基因重排同样阳性。这也证实，细胞蜡块ALK检测不同方法之间的结果具有一致性，在实际应用中，可根据具体情况选择其中一种检测技术。有研究表明，ALK抑制剂能够通过抑制ALK基因相关信号通路发挥抑癌效应[11]。本研究中接受ALK-TKI治疗者，一定时间后可达到完全缓解或部分缓解。在细胞数量充足条件下制备细胞蜡块进行ALK融合基因检测，能够更简便、更精准的诊断肺癌分型，进而给予个性化医疗。联合常规HE染色、免疫组化和分子检测，分析药物靶标、耐药机制、免疫检查点和异质性的鉴定，有利于多元化综合诊断。

综上所述，细胞学样本可以作为ALK基因突变检测的重要样本来源，其检测结果可靠，可以作为临床用药的重要依据。