张明星 李 洁 张玄妮 李欢欢 谢 娟 徐学锋

（华南农业大学食品学院，广州 510642）

鸡枞菌（Termitomyces spp.）主要分布于非洲南部、南亚、东亚以及南太平洋岛屿等热带、亚热带地区，且有研究表明，亚洲与非洲的鸡枞菌存在明显的洲际地理差异[1-2]。目前，我国江苏、福建、台湾、广东、广西、四川、贵州、云南等省均有鸡枞菌分布[3]。鉴于鸡枞菌与白蚁具有紧密的共生关系[鸡枞菌与白蚁共栖于同一生境“菌圃”（即蚁巢，是由白蚁、白蚁排泄物、鸡枞菌及相关的环境微生物协调发育而成的一个共生生态系统）中]，故其分布范围与大白蚁亚科（Macrotermitinae）的分布极为相近[4-5]。

鸡枞菌菌圃中存在大量的微生物，常见真菌类群有炭角菌属（Xylaria）、拟青霉属 （Paecilomyces）、木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）等17属[6-7]。有研究发现，虽然菌圃中存在大量对鸡枞菌生长有威胁的微生物，尤其是炭角菌属真菌和木霉属真菌，且这些真菌也能在菌圃被遗弃时迅速占领菌圃成为优势菌群[8-9]，从而影响鸡枞菌的生长。但通过分子手段在活的菌圃中仅能检测到鸡枞菌[10]，且相关研究也表明，菌圃中存在能抑制这些真菌生长的微生物。例如，菌圃中的芽孢杆菌属（Bacillus）能保护菌圃免受哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）的入侵[11-12]，放线菌（Actinobacteria）能抑制假单胞菌（Pseudomonnas）的生长[13]。当然，菌圃中并非所有的真菌都不利于鸡枞菌的生长，例如，真菌Gigantropanus sp.能在体外刺激鸡枞菌菌丝体的生长[14]。基于这种复杂的共生关系，鸡枞菌生长的秘密始终未被揭示，使得人工驯化困难重重。在此背景下，笔者拟通过分离纯化鸡枞菌菌圃中的微生物，研究菌圃内部微生物的主体类群，并进一步分析菌圃内部微生物的相关联系，从而为阐明鸡枞菌-白蚁-菌圃三元共生体系的内在联系提供初步的研究方向。现将相关研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生鸡枞菌子实体和菌圃发现于华南农业大学，并由食品学院应用真菌实验室保存。

试验试剂为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸提物、可溶性淀粉、高氏一号培养基（广东环凯微生物科技有限公司），葡萄糖、氢氧化钠、盐酸、氯化钾（天津福晨化学试剂厂），氯化钙、氯化钠、重铬酸钾（天津富宇精细化工有限公司），链霉素、氨苄青霉素（美国Biosharp公司），胆酸钠（天津市科密欧化学试剂有限公司），磷酸盐标准缓冲液（pH=6.85）、硼酸盐标准缓冲溶液（pH=9.14）（天津市天新精细化工有限公司）。

试验仪器为HVE-50型全自动高压灭菌锅（日本Hirayama公司）、Mettler-Toledo GB204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、电子显微镜XSP-8CE（上海蔡康光学仪器公司）、SW-CJ-1F超净工作台（江苏苏州安泰空气技术有限公司）、TG-16W台式高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）、FSH-2A可调高速均质机（常州市国旺仪器制造有限公司）、LRH-250A型生化培养箱（广东省医疗器械厂）、SPH-2102C立式恒温培养振荡器（上海四平试验设备有限公司）。

1.2 菌种分离配方

1.2.1 土壤浸提液

土壤取自菌圃周围。土壤与水按质量比1∶1搅拌混合均匀，取上清液。

1.2.2 牛肉蛋白胨培养基

配方为牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂20.0 g，用土壤浸提液定容至1 L，pH为7.4～7.6，在121 ℃高压条件下灭菌20 min。

1.2.3 改良马丁培养基

配方为葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁1.0 g、琼脂20.0 g，用土壤浸提液定容至1 L。

1.2.4 改良高氏培养基

取高氏一号培养基22.5 g，用土壤浸提液定容至1 L。

1.2.5 分散剂

1%胆酸钠、7%生理盐水用于细菌和真菌分离；1%焦磷酸钠、7%生理盐水用于放线菌分离。

1.2.6 抑菌剂

用链霉素10 mg/L、青霉素80 mg/L、重铬酸钾55 mg/L进行真菌分离，用重铬酸钾10 mg/L进行放线菌分离，细菌分离则不加抑菌剂。链霉素、青霉素采用0.22 μm的微孔过滤膜过滤除菌，重铬酸钾采用高温高压灭菌。

1.3 试验方法

微生物分离方式参考闫伟[15]提及的方式，并对其分离条件进行适当优化。分离在无菌条件下操作，取1 g不同位置的菌圃，放入装有99 mL分散剂的250 mL锥形瓶中，在转速10 000 r/min条件下工作1 min左右，再加10粒无菌玻璃珠，于28 ℃恒温摇床上振荡6 h，然后进行10倍梯度稀释，稀释倍数为10-2至10-6。

待溶解培养基温度降至45～55 ℃时，加入相应的抑菌剂并混匀，倒平板。取0.1 mL的菌圃稀释液涂布分离，细菌分别在10-4、10-5、10-6梯度上取，放线菌分别在10-3、10-4、10-5梯度上取，真菌分别在10-2、10-3、10-4梯度上取，每个梯度均设3次重复。

细菌和放线菌培养2～7 d，每天观察记录菌落形态，然后依据菌落形态进行分离纯化，再进行革兰氏染色，然后进行镜检。

将纯化的真菌菌株接种于PDA平板上，置于25℃培养箱内培养，每隔24 h观察菌落颜色、质地、形态以及培养基颜色、渗出物、气味等，同时结合显微形态对真菌进行初步鉴定，并统一编号。真菌形态学特征鉴定主要参照《真菌鉴定手册》《土壤真菌手册》《中国真菌志》等资料。

2 结果与分析

2.1 细菌和放线菌分离纯化

根据鸡枞菌菌圃中可培养菌株在平板上和在显微镜下的形态特征，对菌种进行初步分离，结果见表1。由表1可知，从菌圃中分离出的细菌和放线菌菌株共有383株，菌落形状以椭圆形为主，大多呈扁平、隆起，表面质地以湿润居多；菌株多为杆状，其次为球状；菌株以革兰氏阳性为主，革兰氏阴性菌株仅44株。

表1 菌圃中可培养细菌和放线菌分离株形态特征

2.2 真菌分离及初步鉴定

由表2可知，经初步分离，得到了47株丝状真菌，通过查阅相关文献，以其形态学特征为依据，初步鉴定出43株菌株，有4株无法鉴定。在这43株菌株中，有17株为木霉属，6株为曲霉属，3株为炭角菌属，5株为青霉属，3株为交链孢霉属，3株为镰孢霉属，1株为链霉菌属，1株为高山被孢霉属，1株为毛霉属，1株为截盘多毛孢属，1株为枝孢霉属，1株为鸡枞菌属。43株丝状真菌菌株的具体特征见表3。

表2 菌圃中真菌分离株在各属的分布

表3 菌圃中真菌分离株的具体特征

3 结论与讨论

鉴于菌圃微生物的分离受分散剂、分散方式、培养基及培养条件等因素的影响，本研究在参考闫伟[15]的分离方法后，根据本研究材料特点，对分散剂、分散方式、培养基等进行了适当优化，最终取得了较好的分离效果，从鸡枞菌菌圃中成功分离出了383株细菌及放射菌、47株丝状真菌，其中能根据菌株形态学特征进行初步鉴定的丝状真菌有43株。但这43株丝状真菌的属与前人研究结果（鸡枞菌圃中主要存在的丝状真菌有炭角菌、木霉、青霉、拟青霉、曲霉、芽枝霉等[8-9,16-17]）有所差异。另外，本试验除了分离出炭角菌、木霉、青霉、曲霉等真菌外，还分离出了交链孢霉、镰孢霉、链霉菌、高山被孢霉、毛霉等真菌，这可能与白蚁所处的地域、白蚁的饮食和习性有关。

鉴于鸡枞菌菌圃成熟程度不同，其菌群结构存在差异，在以后的研究中，可利用人工饲养系统[18]，对婚飞前（刚婚飞）的白蚁巢穴中的菌圃和出菇后的菌圃进行挖掘，并以白蚁新鲜粪便为对照，全面观察鸡枞菌生长周期中的菌群变化情况，找出其中主要发生变化的菌群，并对其基质成分进行分析，以期了解菌群变化与基质成分之间的关系。同时，未来也可通过共同培养，探明对鸡枞菌生长有促进作用的真菌菌株。