范土贵，陈建平, ，高加龙，钟赛意，秦小明

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，广东省海洋生物制品工程实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东湛江 524088；2.大连工业大学，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116034）

众所周知，肝脏是人体重要代谢器官，能将不利于体内代谢的物质转化为无毒物质排出体外[1]。长期饮酒及过量饮酒会对人体肝脏造成伤害，导致酒精性肝损伤继而在严重情况下引发肝癌[2]。因此，如何有效地保护肝脏免受酒精的损伤从而预防肝癌的发生成为目前医药和食品领域研究的热点。近年来，具有低毒副作用、多途径、多靶点作用的天然产物如黄酮类和多酚类等备受关注。研究发现，这类天然产物能够通过提高肝脏组织的抗炎症反应、抗氧化应激和抗细胞凋亡的能力以及调节脂质代谢、乙醇代谢和肠道微生物等途径改善肝损伤，从而保护肝脏组织[3]。

姜黄素是一种从姜科植物根茎中提取得到的脂溶性多酚类物质[4]。作为一种食品添加剂，姜黄素广泛应用于糕点、罐头、饮料等食品中[5]。研究发现，姜黄素具有很好的护肝效应，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各种化学药物引起的肝损伤[6−9]。进一步的机理研究表明，姜黄素通过能够上调Nrf2-ARE信号通路中Nrf2蛋白的表达量来保护肝脏[10−11]。因此，姜黄素具有较好的应用前景。然而，姜黄素的水溶性差及生物利用度低限制了它在酒精性肝损伤防治方面的应用。为此本课题组在前期研究中，利用β-环糊精聚合物作为药物载体，通过超分子化学作用制备得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP[12]。本研究在前期研究的基础上，主要考察CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用，为其在保护酒精性肝损伤中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

姜黄素超分子包合物 实验室自制；姜黄素（Curcumin, CUR）标准品 美国Sigma公司；细胞裂解液RAPI、BCA蛋白测试盒和活性氧检测试剂盒

碧云天生物技术有限公司；总超氧化物歧化酶测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒、丙二醛测试盒、乳酸脱氢酶测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶测试盒和丙氨酸氨基转移酶测试盒 南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶溶液和双抗溶液 美国Gibco公司；异丙醇、二甲基亚砜（DMSO）溶液 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；MTT试剂 分析纯，上海源叶生物科技有限公司；LO2细胞 购于美国ATCC公司;β-环糊精 化学纯，山东新大精细化工有限公司；其他化学试剂 均购于国药集团化学试剂有限公司。

AUW120电子天平 日本岛津公司；XRDKQ-500DB型数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；Varioskan Flash多功能酶标仪、移液枪 美国Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科学有限公司；HL-6数显恒温水浴锅

常州奥华仪器有限公司；Eppendorf 5810R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；FD8508真空冷冻干燥机

韩国ilshin公司；EYELA旋转蒸发仪 日本EYELA公司；CKX41倒置显微镜 日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CUR/CDP的制备 CUR/CDP的具体制备方法参考陈建平等[13−14]方法进行。称取15.76 g NaOH和20 gβ-环糊精，加32 mL H2O搅拌溶解，在30 ℃下缓慢加入环氧氯丙烷（EPC）9.64 mL，搅拌24 h后，冷却至室温。经超声功率为80 W超声5 min后，将溶液倒入透析袋屮透析至中性，抽滤去除不溶物，经0.45 μm纤维素膜过滤后旋蒸至粘稠状，加入无水乙醇析出白色固体，经过滤、真空干燥即得β-环糊精聚合物。将姜黄素和β-环糊精聚合物按质量比1:4研磨混匀，加50 mL蒸馏水，在120 W下超声5 min后，经磁力搅拌2 d，将溶液抽滤、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黄素超分子包合物。

1.2.2 细胞培养 LO2细胞经复苏后转移至DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清和1%双抗溶液）中，并将细胞培养瓶置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞密度长至80%左右时进行传代，取对数生长期的细胞用于后续的实验。

1.2.3 乙醇诱导LO2细胞损伤模型的建立 在实验组与对照组加入8×104个细胞/mL的细胞悬液于96孔板中，而空白组中用DMEM高糖培养基代替细胞悬液，每孔100 μL。培养24 h后去除培养基，然后，实验组中加入200 μL不同浓度（100~800 mmol/L）的乙醇溶液，而空白组和对照组中均分别加入200 μL DMEM高糖培养基。培养6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。然后，用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO反应10 min。采用酶标仪测量各个孔在570 nm处的吸光值。根据公式（1）计算细胞存活率。

式中：A0表示空白组的OD值；A1表示对照组的OD值；A2表示实验组的OD值。

1.2.4 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤的影响

在实验组与阴性对照组加入8×104个细胞/mL的细胞悬液于96孔板中，而空白组中用DMEM高糖培养基代替细胞悬液，每孔100 μL。培养24 h后，实验组中加入100 μL 不同浓度（0~80 μg/mL）的CUR/CDP，而空白组和阴性对照组中均分别加入100 μL DMEM高糖培养基。培养12 h后，采用移液器抽掉培养基。然后，实验组中加入200 μL 600 mmol/L乙醇，而空白组和阴性对照组中均分别加入200 μL DMEM高糖培养基。培养6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h。然后，采用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO溶液反应10 min。采用酶标仪测量各个孔在570 nm处的吸光值。根据式（1）计算细胞存活率。

1.2.5 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影响 将LO2细胞悬液以2×105个细胞/mL的密度接种于无菌培养皿中，每个培养皿添加5 mL的DMEM高糖培养基，培养24 h后，分别加入不同浓度的CUR/CDP培养12 h后去除培养液，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培养6 h后，将培养液收集于离心管中。根据ALT、AST和LDH试剂盒的操作方法检测细胞培养液中ALT、AST和LDH活力。并根据SOD、GSHPX和MDA试剂盒的操作方法检测细胞内的SOD、GSH-PX活力和MDA含量。

1.2.6 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后ROS含量的影响 将LO2细胞以8×104个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，分别加入100 μL不同浓度的CUR/CDP培养12 h后用移液器去除培养液，加入200 μL 600 mmol/L乙醇培养6 h后，加入300 μL DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗涤3次，采用酶标仪测量各个孔在激发波长为488 nm、发射波长为525 nm条件下的荧光强度。

1.3 数据处理

每次实验重复3次，实验数据均以平均值±标准差（x ¯±s）表示。实验结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，采用T检验对两组之间的数据进行比较，P<0.05为差异具有显著意义，P<0.01为差异具有极限显著意义。

2 结果与分析

2.1 LO2细胞损伤模型的建立

由图1可知，细胞经不同浓度的乙醇处理6 h后，细胞存活率随着乙醇浓度的升高呈下降趋势。当乙醇浓度为600 mmol/L时，细胞存活率从对照组的100%±6.57%下降至54.79%±4.41%（P<0.05），为中度损伤。故选择此浓度进行后续实验。

图 1 不同浓度的乙醇对LO2细胞存活率的影响Fig.1 Effects of different ethanol concentrations on the cell viability of LO2 cells

2.2 CUR/CDP对乙醇损伤LO2细胞存活率的影响

由图2可知，当80 μg/mL CUR/CDP对细胞进行单独处理后，细胞存活率从阴性对照组的100%下降到89.61%±1.87%，表现出轻微的细胞毒性。然而，相比600 mmol/L乙醇单独处理的模型对照组，当细胞经10~80 μg/mL CUR/CDP处理后，可以显著提高细胞经乙醇处理后的细胞存活率（P<0.05），且呈现出对包合物浓度的依赖性。当CUR/CDP浓度达到80 μg/mL时，细胞存活率从54.75%±8.97%（模型对照组）提高到85.27%±2.64%，表明CUR/CDP对乙醇诱导细胞损伤具有保护作用，这可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性降低了乙醇诱导细胞内ROS的产生，从而起到保护肝细胞损伤的作用。

图 2 CUR/CDP对乙醇损伤LO2细胞存活率的影响Fig.2 Effects of CUR/CDP on the cell viability of LO2 cells injured by ethanol

2.3 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后ALT、AST和LDH活力的影响

由表1可知，与阴性对照组相比，模型对照组中的ALT、AST和LDH活力极显著上升（P<0.01）；相比模型对照组，细胞经10~80 μg/mL CUR/CDP处理后，能降低ALT、AST和LDH活力，且呈现出浓度依赖性。当CUR/CDP的浓度达到80 μg/mL时，ALT、AST和LDH活力从模型组的（26.47±0.90）、（41.02±4.41）和（63.77±4.95）U/L降至（16.17±0.42）、（22.62±0.79）和（32.25±1.69）U/L。这可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性避免了细胞因ROS含量的升高导致其细胞膜破损引发细胞内ALT、AST和LDH的释放，使得细胞外ALT、AST和LDH活力相应降低。

2.4 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影响

由表2可知，与阴性对照组相比，模型对照组中的SOD和GSH-PX活力极显著降低，而MDA的含量极显著上升（P<0.01）；相比模型对照组，细胞经10~80 μg/mL CUR/CDP处理后，能升高SOD、GSH-PX活力和降低MDA的含量，并且表现出浓度依赖性。当CUR/CDP浓度达到80 μg/mL时，SOD、GSH-PX活力从模型组的（8.45±1.11）、（21.82±1.34）U/mg prot增至（16.47±1.27）、（36.70±0.56）U/mg prot，而MDA含量从模型组的（1.19±0.15）nmol/mg prot降低到（0.72±0.05）nmol/mg prot。这可能是由于CUR/CDP处理细胞后，其抗氧化作用提高了细胞内抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，从而清除了细胞内乙醇诱导产生的ROS，进而降低了MDA的含量。

2.5 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后活性氧（ROS）含量的影响

由图3可知，与阴性对照组相比，模型对照组中ROS含量极显著上升（P<0.01）；而经CUR/CDP处理后，能明显降低细胞内ROS含量，当CUR/CDP浓度达到80 μg/mL时，ROS含量从模型对照组198.02%±11.76%降低到110.87%±10.22%。实验结果表明，CUR/CDP是通过降低ROS含量来减轻乙醇诱导LO2细胞的损伤。这可能是由于细胞经CUR/CDP预处理后，其抗氧化作用能够有效清除细胞内的自由基使得细胞内ROS的含量降低，达到保护细胞的目的。

表 1 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后ALT、AST和LDH活力的影响Table 1 Effects of CUR/CDP on the activities of ALT, AST and LDH in the culture medium of LO2 cells damaged by ethanol

表 2 CUR/CDP对乙醇损伤LO2细胞中SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量的影响Table 2 Effects of CUR/CDP on SOD activity, GSH-PX activity and MDA contents in LO2 cells damaged by ethanol

图 3 CUR/CDP对乙醇诱导LO2细胞损伤后ROS含量的影响Fig.3 Effects of CUR/CDP on ROS content in LO2 cells damaged by ethanol

3 讨论

尽管目前有文献报道酒精性肝损伤的相关发病机制，但其具体的发病机理尚无定论。有研究认为，酒精代谢产物、氧化应激、炎症介质等与酒精性肝损伤有关。长期或过量摄入酒精会使酒精在肝脏的代谢过程中抑制线粒体中乙醛的氧化反应，造成酒精代谢产物乙醛在肝脏中不断地积累[15]。肝脏中积累的乙醛会破坏肝细胞的内膜结构、损伤线粒体、影响肝脏的微管系统、引起肝纤维化等，从而导致肝损伤[16]。而且，机体内过量的酒精会在肝脏中发生氧化反应导致机体产生大量的活性氧，同时也会造成谷胱甘肽等抗氧化物质含量显著降低，从而导致线粒体结构遭到破坏，最终引起肝脏损伤[17]。

在正常情况下，ALT、AST和LDH主要存在于肝细胞中，当肝细胞受到损伤时，ALT、AST和LDH会被释放到培养液中，使得细胞培养液中的ALT、AST和LDH含量显著升高，故通过检测培养液中ALT、AST和LDH的含量可反映出肝细胞的受损程度[3,18−19]。在本研究中，经过乙醇损伤后LO2细胞培养液中ALT、AST和LDH活力极显著升高（P<0.01），这说明乙醇破坏了LO2细胞的细胞膜结构，对LO2细胞造成了一定程度的损伤。经10~80 μg/mL CUR/CDP预处理后，LO2细胞培养液中ALT、AST和LDH活力随着CUR/CDP浓度的升高逐渐降低，这说明CUR/CDP对LO2细胞具有保护其细胞膜结构的能力。

MDA是细胞内脂质发生氧化反应后的主要产物，细胞内MDA的含量反映了细胞内脂质过氧化的程度[20]。GSH-PX是细胞内的一种过氧化物酶，能够清除细胞内发生了氧化反应的脂质[21]。SOD是机体防御细胞发生氧化反应的首要防线，能够快速地清除氧自由基，防止机体受到损伤[22−23]。当细胞受到损伤时，细胞内的GSH-PX和SOD可以通过清除细胞内被氧化的脂质以及氧自由基来维持细胞内的氧化还原稳态，从而达到保护细胞的作用。在本研究中，经乙醇损伤后，细胞内GSH-PX活力和SOD的活力出现极显著降低（P<0.01），MDA的含量极显著上升（P<0.01），这说明乙醇破坏了细胞内的氧化还原稳态，使得细胞受到损伤。当LO2细胞经CUR/CDP预处理后，细胞内GSH-PX活力和SOD活力明显恢复，MDA含量明显降低，表明CUR/CDP能够改善乙醇对细胞造成的损伤。

乙醇在肝脏中会被细胞色素P450（CYP2E1）氧化，此过程会产生过量的活性氧（ROS），而ROS是细胞内氧化应激状态发生的重要因素之一[24]。当肝脏受到过量乙醇刺激时，肝细胞内ROS的含量会显著增加，从而导致肝损伤[25−27]。在本研究中发现，经10~80 μg/mL CUR/CDP处理乙醇诱导的细胞后，细胞内ROS含量随着CUR/CDP浓度的增加呈降低趋势，表明，CUR/CDP能够抑制乙醇诱导细胞内的氧化应激状态，从而达到保护细胞的目的。

4 结论

本文通过建立乙醇诱导肝细胞损伤模型和采用ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX、MDA和ROS试剂盒检测CUR/CDP对乙醇诱导细胞损伤后其相关酶活性和MDA、ROS含量的影响。研究发现，CUR/CDP能够降低ALT、AST、LDH、MDA和ROS的含量，同时也能恢复SOD和GSH-PX的活力，这表明CUR/CDP通过提高细胞内抗氧化酶的活力以及降低MDA和ROS含量来达到保护细胞的目的。综上所述，姜黄素超分子包合物具有改善乙醇诱导LO2细胞损伤的能力，为其今后在肝损伤领域和预防肝癌等临床的应用与开发提供了理论基础和数据参考。