叶秋萍，林丽霞，洪翠云，林志平

（1.福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建厦门 361006；2.厦门市同安区恒利茶叶有限公司，福建厦门 361100）

膳食纤维（dietary fiber, DF）被称为人类的第七大营养素，是一类不能被人体消化酶消化、也不能被小肠吸收的以多糖为主的高分子物质的总称，主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素及树胶、果胶、粘质等[1]。膳食纤维根据溶解性，可分为不溶性膳食纤维（IDF）和可溶性膳食纤维（SDF）[2]。研究发现膳食纤维具有降三高、缓解便秘、改善肠道菌群、预防肥胖症、预防糖尿病、动脉硬化、高脂血症、预防肿瘤、抗氧化等生理功能[3−7]。膳食纤维主要来源于谷物类、豆类、玉米、水果类、蔬菜类、中药材等[8−12]，广泛应用于食品加工业中对食品进行增稠和填充[13]。

目前膳食纤维的制备方法主要有化学法、酶法、发酵法、膜分离法及多方法辅助提取法等[14]，化学法一般采用酸碱试剂进行浸提处理[15]，虽然制备膳食纤维的得率较高，但生产过程易产生污染，且膳食纤维的生物活性降低；酶法制备膳食纤维工艺温度较低、污染少、产品无溶剂残留，但是酶制剂成本较高，适用于含有高含量淀粉和蛋白质的原料制备膳食纤维[16]；膜分离法由于对设备和分离技术的要求较高，难以实现大生产[17]。发酵法是利用微生物发酵提供的酸性环境，产生的酶类使原料中的成分如蛋白质、脂肪、淀粉等发生反应分解，获得膳食纤维的方法[18]。该法能有效促进IDF（不可溶膳食纤维）向SDF（可溶性膳食纤维）转化，提取的膳食纤维实用性和生物活性较高，目前用得较多的菌种有乳酸菌和绿色木霉，而绿色木霉具有菌体生长较快、产酶周期短的优越性[19]。熊俐等[20]采用绿色木霉制备黄豆渣膳食纤维，发现pH为5，发酵时间108 h，温度32 ℃，装液量115 mL/250 mL，接种量10%，二次发酵后，水溶性膳食纤维的含量显著提高、得率为12.03%，产品的感官品质较佳，且持水力为10.31 g/g，膨胀力为11.21 mL/g。徐灵芝等[21]采用绿色木霉制备雷竹笋渣膳食纤维，研究发现料液比10:1、发酵时间60 h、接种量6%、温度32 ℃、pH为5.8，膳食纤维的得率为79.33%，显著改善了膳食纤维的持水力、溶胀力和结合水力等理化品质。Jia等[22]采用绿色木霉发酵米糠制备SDF，发现发酵后的米糠SDF的水合性有明显提高。

我国是世界主要的产茶国之一，产量居世界首位。然而在茶叶精制过程中会产生大量的茶梗、茶末等副产物，其中茶梗约占茶叶毛重的30%。目前有采用酸法[23]、碱法[24]和酶法[25]制备茶渣水不溶性膳食纤维，采用酶法制备茶渣可溶性膳食纤维[26]，碱法提取茶末水溶性膳食纤维[27]，乳酸菌发酵法制备茶渣可溶性膳食纤维[18]。膳食纤维是茶梗的主要组成成分，但目前对采用发酵法制备茶梗水溶性膳食纤维未见报道。本文拟以茶梗为原料，采用绿色木霉发酵法制备可溶性膳食纤维，获得最佳工艺参数，并分析其主要性能指标，为提升茶梗的附加值开拓新的渠道。

1 材料与仪器

1.1 材料与仪器

茶梗（安溪铁观音） 置于70 ℃烘箱中干燥1 h，混匀、粉碎过40目筛；绿色木霉 菌株号为GDMCC3.141 广东省微生物菌种保藏中心；95%乙醇、磷酸二氢钾、硫酸铵 均为分析纯，西陇科学股份有限公司；马铃薯葡萄糖水、马铃薯葡萄糖琼脂 广东环凯微生物科技有限公司。

HVA-85 高压灭菌器 日本平山制作所株式会社；SW-CJ-1FD超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；DNP-9162型培养箱 上海精宏实验设备有限公司；DHG-9240A恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；Agilent 1200液相色谱仪

美国Agilent；XL30ESEM电镜 飞利浦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备工艺

1.2.1.1 工艺流程

1.2.1.2 发酵剂的制备 菌种活化：将绿色木霉菌株的干粉用0.1~0.2 mL的培养液或者无菌水溶解，接种至马铃薯培养基斜面上，在28 ℃下培养7 d；用无菌水将孢子洗下，适度稀释，进行扩大培养；接种菌种至马铃薯汁培养基中，在30 ℃下培养24 h，活化2次，形成孢子悬液。

菌种驯化：将获得的孢子悬液接种至茶梗汁混合液于30 ℃下培养24 h，驯化2次；再接种至茶梗汁混合液于30 ℃下培养24 h，绿色木霉菌总数达到107~108cfu/mL，作为发酵剂。

1.2.1.3 膳食纤维制备 将称量好的茶梗粉装入三角瓶中，加入硫酸铵0.3 g、磷酸二氢钾0.325 g、纯水100 mL，调节pH，于121 ℃下灭菌20 min，冷却；将发酵剂接种到灭菌后的茶梗培养液中培养；将发酵液抽滤，滤液加入4倍体积95%乙醇，静置3~5 h，置于转速为5000 r/min的离心机中离心10 min、过滤，将沉淀物置于70 ℃下烘干5~7 h至干燥、粉碎，获得膳食纤维。

1.2.2 单因素实验 恒定茶梗粉重量为10g，分别研究不同发酵剂接种量（1%、2%、4%、6%、8%）、时间（24、36、48、60、72 h）、温度（26、28、30、32、34 ℃）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）等因素对茶梗SDF得率的影响。

1.2.2.1 发酵剂接种量的影响 称取茶梗粉10 g，在发酵时间为60 h、发酵温度为30 ℃、pH5.0下，分别采用不同发酵剂接种量1%、2%、4%、6%、8%进行制备，计算茶梗SDF得率。

1.2.2.2 时间的影响 称取茶梗粉10 g，在发酵温度为30 ℃、发酵剂接种量为4%、pH5.0下，分别采用不同发酵时间24、36、48、60、72 h进行制备，计算茶梗SDF得率。

1.2.2.3 温度的影响 称取茶梗粉10 g，在发酵时间为60 h、发酵剂接种量为4%、pH5.0下，分别采用不同发酵温度26、28、30、32、34 ℃进行制备，计算茶梗SDF得率。

1.2.2.4 pH的影响 称取茶梗粉10 g，在发酵时间为60 h、发酵剂接种量为4%、发酵温度为30 ℃下，分别采用不同pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行制备，计算茶梗SDF得率。

1.2.3 正交试验 在单因素实验基础上，以发酵剂接种量、时间、温度、pH为考察因素，以SDF得率为考察指标，进行四因素三水平L9（34）正交实验设计，筛选发酵法制备膳食纤维的最佳条件，实验因素及水平设计见表1。

表 1 四因素三水平正交试验表Table 1 Orthogonal test table of four factors and three levels

1.2.4 测定项目与计算方法

1.2.4.1 可溶性膳食纤维（SDF）得率计算

1.2.4.2 微观结构观察 将样品干燥至质量恒定，取适量黏合在样品台上，利用离子溅射法对样品进行镀膜，然后置于扫描电子显微镜下观察。

1.2.4.3 单糖组成检测方法 样品前处理方法：称取适量制备的可溶性膳食纤维样品于100 mL锥形瓶中，加水，缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5 mL，室温振荡1 h，离心，用干燥滤纸过滤，定容。

完全酸水解：取1 mL样品，加入4 mol/L三氟乙酸溶液1.0 mL，在120 ℃条件下水解120 min。70 ℃水浴，氮吹仪吹干。

PMP衍生化：向水解干燥后得到的单糖样品中加入溶于无水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮试剂和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混匀后，水浴70 ℃反应30 min。冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl 0.5mL，充分混匀。加入1 mL氯仿。充分振荡萃取，去除氯仿层，共萃取三次。水层用0.22 μm滤膜过滤后，待上机。

检测条件：Agilent 1200液相色谱仪，色谱柱：Thermo C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动 相为0.1 mol/L pH6.7磷酸盐缓冲溶液:乙腈=83:17（v/v）流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为 10 μL；波长为250 nm。

1.2.4.4 持水率测定 称取2 g膳食纤维粉放入烧杯中，然后加入150 mL蒸馏水，搅拌均匀，静置2 h后，将纤维用快速滤纸滤去多余水分，把保留在滤纸上的湿样品转移到表面皿中称重，再将表面皿放入110 ℃的烘箱中，烘烤至恒重，在干燥器中冷却后称重，计算持水率[28]。

1.2.4.5 膨胀率测定 准确称取制备的膳食纤维粉0.1 mg置于量筒中，准确吸取5 mL蒸馏水加入其中，振荡均匀后室温放置24 h，读取量筒中膳食纤维的体积，计算膨胀率[28]。

1.2.4.6 清除DPPH自由基能力测定 在2.0 mL样品液（接种量为6%，时间为60 h，温度为30 ℃，pH为5.0下制备的膳食纤维）中加入2.0 mL的DPPH溶液（0.1 mmol/L，无水乙醇配制），充分混合后避光反应 30 min，最后于517 nm处测吸光值（A1）。同时测定2.0 mL的DPPH溶液（0.1 mmol/L）与2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（A2），以及2.0 mL相应浓度的样液与2.0 mL无水乙醇混合液的吸光度（A3）。用95%乙醇代替反应液作空白对照[29]。以抗坏血酸作为对照。清除率计算公式为：

1.2.4.7 还原能力测定 取0.1 mL样品溶液，加入1.5 mL磷酸盐缓冲溶（0.2 mol/L、pH6.6）和1.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，摇匀，50 ℃反应20 min后加入1.5 mL 10%的三氯乙酸溶液终止反应，再加入3 mL去离子水和0.6 mL 0.1%的氯化铁，摇匀后于700 nm处测吸光值，反应液中以0.6 mL蒸馏水代替0.1%的氯化铁做空白，以抗坏血酸作为对照。吸光度越大，样品的还原能力越大，亦即抗氧化性越强[29]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 处理数据，结果以平均值±标准差表示，试验重复三次；采用SPSS19.0软件对数据进行显著性分析，利用单因素ANOVA和Duncan多重比较分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 茶梗粉SDF制备单因素实验结果

2.1.1 不同发酵剂接种量对SDF得率的影响 考察发酵过程不同发酵剂接种量下SDF得率的变化，结果如表2所示。由表2可知，SDF得率随发酵剂接种量增加呈先增加后减小的趋势。当接种量为4%时，SDF的得率最高达到7.09%，极显著高于其他处理（P<0.01)，说明该接种量下绿色木霉能很好地分解膳食纤维；发酵液中营养物质是恒定的，随着接种量的增加，不能为绿色木霉菌提供充足的营养，导致发酵产生的酶不能完全分解茶梗中的膳食纤维，使得得率减少。因此，适宜的发酵剂接种量为4%。

表 2 不同发酵剂接种量对SDF得率的影响Table 2 Effect of inoculums of starter culture on SDF yield

2.1.2 不同时间对SDF得率的影响 考察发酵过程不同发酵时间下SDF得率的变化，结果如表3所示。

表 3 不同时间对SDF得率的影响Table 3 Effect of different time on SDF yield

由表3可知，随着发酵时间的延长，SDF得率先是出现了快速增长，当达到60 h时，得率达到了最大值7.16%，极显著高于其他处理（P<0.01)，说明此时发酵液中由绿色木霉发酵产生的酶活力最强，能较好的分解产生SDF；而后时间增加SDF得率出现了下降趋势，可能是由于发酵时间太长，活菌活力降低，死亡菌增多，失活的菌体被留在茶梗粉中，从而影响了得率[30]，这与熊俐等[20]采用绿色木霉发酵制备黄豆渣膳食纤维的趋势相同。因此，选择60 h作为发酵的最佳时间。

2.1.3 不同温度对SDF得率的影响 考察发酵过程不同发酵温度下SDF得率的变化，结果如表4所示。由表4可知，随着温度的上升，SDF得率出现了先增加后减少的趋势，当温度达到30 ℃时，SDF得率最高达到7.36%，极显著高于其他处理（P<0.01)，说明该温度下绿色木霉菌体生长良好，能很好地分解茶梗中的膳食纤维；温度较低绿色木霉菌生长缓慢，从而影响了发酵；温度太高也会抑制菌体生长，从而减少了酶的生成导致SDF得率下降。30 ℃处理的得率最高且较为节能，说明30 ℃为最佳发酵温度。对比发现，32和34 ℃处理下SDF得率极显著高于28 ℃处理（P<0.01)，所以选用发酵温度为30、32和34 ℃这三个水进行后续考察。

2.1.4 不同pH对SDF得率的影响 考察发酵过程不同pH下SDF得率的变化，结果如表5所示。由表5可知，随着pH的增加，SDF得率逐渐增加，当pH达到5.0时，得率最高达到7.11%，极显著高于其他处理（P<0.01)，pH继续增加而得率则出现下降，说明pH过高或过低都不利于绿色木霉生长，不利于酶的产生，从而影响了SDF的产出。因此，选择pH为5.0为最佳发酵pH。

表 4 不同温度对SDF得率的影响Table 4 Effect of different temperature on SDF yield

表 5 不同pH对SDF得率的影响Table 5 Effect of different pH value on SDF yield

2.2 正交试验

根据单因素实验结果，为进一步优化发酵条件，对发酵剂接种量、时间、温度和pH设计了四因素三水平L9（34）正交试验，结果如表6所示。由表6可知，处理8的SDF得率极显著高于其他处理（P<0.01)，结合正交结果分析发现影响发酵过程SDF得率各因素主次顺序为：A>C>D>B，即接种量>温度>pH>时间，最优的发酵工艺参数组合为：A3B2C1D2，即接种量为6%，时间为60 h，温度为30 ℃，pH为5.0，进一步做验证试验，重复三次，测得SDF的平均得率为7.15%，与正交试验处理8的得率相接近，略低于单因素试验的最高得率7.36%，主要是因为接种量有所增加导致发酵产生的酶不能完全分解茶梗中的膳食纤维，使得得率略有下降。

表 6 正交试验结果Table 6 Orthogonal test results

2.3 茶梗SDF微观结构观测

采用扫描电镜观测茶梗SDF表面形态特征，观测其微观结构变化，研究茶梗SDF表面形态结构对其水合性能的影响，结果如图1所示。由图1可知，茶梗和发酵后茶梗SDF采用扫描电镜放大10000倍后发现，茶梗表面结构较为光滑、结构紧密，而发酵后茶梗SDF颗粒表面凹凸不平，成疏松多孔的结构，且形成断层结构，前人研究发现SDF的水合性能和对葡萄糖的吸收能力与膳食纤维的多孔结构有关[31]。这些孔隙有利于扩大SDF颗粒的表面积，有利于SDF吸附更多的水分子和油分子[32]，对提高SDF的持水率和膨胀率有积极的促进作用。

图 1 茶梗SDF扫描电镜图Fig.1 Scanning electron microscope (SDF) of tea stalk

图 2 茶梗SDF的单糖组成高效液相色谱图Fig.2 High-performance liquid chromatography of monosaccharide composition in SDF of tea stalk

2.4 茶梗SDF 单糖组成分析

为进一步分析制备的茶梗SDF的单糖组分分布，采用高效液相色谱进行检测，结果如图2、表7所示。由图2、表7可知，茶梗SDF主要由10种单糖组成，包括甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。其中半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖含量较高，分别为2766.23、2721.37和1905.82 mg/kg，这三种糖是果胶类物质的主要成分，而果胶类物质属于可溶性膳食纤维中。这与咖啡皮制备的SDF中果胶单糖主要成分为半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖的结果相近[33]。而木糖、核糖和葡萄糖等含量较低，主要是淀粉和纤维素水解得到的[17]。因此，发酵法制备的茶梗SDF中支链较少的果胶单糖含量较高，其水溶性较好。

2.5 茶梗SDF理化性质分析

可溶性膳食纤维理化性质是衡量其生理活性好坏的标准，对发酵前后茶梗SDF的持水率、膨胀率、清除DPPH自由基等指标进行测试，结果如表8所示。由表8可知，制备的茶梗SDF的持水率和膨胀率大于茶梗中的，说明采用绿色木霉发酵有利于增加SDF亲水性基团，具有很强的水合作用[34]，这也有可能是由前面研究发现的茶梗SDF具有多孔隙的微观结构及含有较高含量的果胶单糖所引起的。茶梗SDF的持水率549.20%高于采用酵母菌发酵制备的麸皮SDF的持水率432%[35]，高于脱脂椰蓉SDF的持水率380%和膨胀率3.1 mg/L[36]、高于酶解和碱处理相结合的茶梗SDF的持水率509.57%和膨胀率4.20 mg/L[37]，这可能是因为绿色木霉发酵能使茶梗的粒度减小、比表面积增大[38]，并且可能引起非水溶性膳食纤维分子中亲自基团暴露率增大[35]，从而提高发酵后茶梗SDF的持水率和膨胀率。清除DPPH自由基和还原能力是表征可溶性膳食纤维抗氧化强弱的指标。由表8可知，茶梗SDF的DPPH自由基清除率12.41%高于茶梗11.63%，高于豆渣中SDF-1（1倍乙醇）和SDF-3（3倍乙醇）[38]，且茶梗SDF的还原能力为14.71%，也高于发酵前茶梗中的9.20%，说明采用绿色木霉发酵法制备的茶梗SDF具有一定的抗氧化活性。

表 7 茶梗SDF的单糖含量Table 7 Content of monosaccharide in SDF of tea stem

表 8 发酵前后茶梗中SDF的理化性质Table 8 Physicochemical properties of SDF in tea stalks before and after fermentation

3 结论

采用发酵法制备茶梗可溶性膳食纤维，通过单因素实验及正交试验法对工艺参数进行优化，获得最佳工艺参数为：绿色木霉菌接种量为6%，发酵时间为60 h，发酵温度为30 ℃，pH为5.0，该条件下茶梗SDF的得率为7.15%。该法制备的茶梗SDF色泽均匀、呈姜黄色的粉末，与酸碱法、酶法等工艺相比，具有绿色环保、无溶剂残留的特点。

在10000倍扫描电镜下观测茶梗SDF，发现颗粒表面凹凸不平，成疏松多孔的结构。采用高效液相色谱仪测定SDF中的单糖组成，含量较高的组分主要是支链较少的多糖组分包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖，属于果胶类物质。而具有多孔的结构及含量较高果胶单糖的茶梗SDF能更好地吸附水分子。经检测SDF的持水率达到549.20%，膨胀率为5.22 mg/L，清除DPPH自由基能力为12.41%，还原能力为14.71%，表明其具有较好水合性能，且水合性能和抗氧化性能均优于原料，这与结构观测及色谱测定结果相一致。因此，采用发酵法制备茶梗可溶性膳食纤维为拓宽茶叶副产物的综合开发利用提供了有效渠道，有利于提高其附加值。将可溶性膳食纤维添加到食品中不仅可改善其结构性能、口感感觉，还有利于促进人体健康。