钱柏霖，尤留超，张 钺，莘 余，吕尚揆，肖劲邦，苏柘僮，董 可，裴淼毓，左昌雄，杨世林，冯育林*，沈留红*

（1.四川农业大学 动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室/奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130；2.广西英路维特药物有限公司，广西 荔浦 541100；3.四川育强本草生物技术有限公司，四川 成都 611130；4.江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006）

【研究意义】临床型乳房炎是奶牛养殖业危害最为严重的疾病之一，不仅会降低奶牛生产性能、泌乳量和乳品质，而且治疗周期长、成本高，严重影响牧场效益。目前国内外主要通过使用各种抗菌药物防治该病，然而长期、大量反复使用抗菌药物不仅导致疗效下降、抗生素残留和耐药菌株产生等问题，还严重危害人类健康。为配合农业农村部开展的“兽用抗菌药使用减量化行动”，探寻天然高效、无耐药性和乳汁残留的抗生素替代药物极具研究价值，对奶牛养殖业具有重要意义。【前人研究进展】奶牛发生乳房炎时，致炎因素刺激机体免疫细胞产生白细胞介素-1（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等炎症介质[1]，损伤乳腺细胞并导致血管扩张，促使血液中白细胞进入乳汁，引起体细胞数（somatic cell counts，SCC）升高并产生炎症反应[2]。在体细胞溶酶体酶作用下，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-d-glucosaminidase，NAG）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，AST）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）等活性改变[3-4]。同时，炎症反应导致机体氧化-抗氧化失衡，使总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化指标水平降低，丙二醛（malonaldehyde，MDA）堆积，造成乳腺氧化损伤[5]。【本研究切入点】白头翁及其提取物皂苷B4 可明显抑制金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌等[6]，下调IL-1β、IL-6和TNF-α水平，抑制脂多糖诱导的炎症反应[7]，提高机体抗氧化和抗凋亡功能[8]，增强细胞免疫和体液免疫应答[9]，兼具药物和营养剂双重作用，高效低毒且不易产生耐药性和乳汁残留，在替代抗生素治疗乳房方面极具潜力和研究价值，且其治疗临床型乳房炎奶牛疗效显著[10]。【拟解决的关键问题】本试验旨在探究白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳汁SCC，乳清酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 和抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA的影响，为其防治奶牛临床型乳房炎提供数据支持，并为其临床推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用规模化半封闭统一舍饲，2～3胎次泌乳高峰期、泌乳天数、产奶量相近的临床检查健康和临床型乳房炎中国荷斯坦奶牛各12头，自由饮水，统一全混合日粮饲喂，试验期间均无其他疾病发生，试验前后也未接受抗生素治疗。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 体细胞检测仪，De Laval，瑞士；台式离心机，TGLB-16G，Sigma；超低温冰箱，DW-86L828W，海尔；超净工作台，SW-CJ-1F，苏净集团；全波长酶标仪，Varioskan Flash，美国；紫外可见分光光度计，Lambda 45，美国；电子恒温水浴锅，DZKW-4，北京中兴；微量加样器，LH99186，美国Thermo。

1.2.2 主要试剂 白头翁皂苷B4 注射液（100 mL/瓶，白头翁皂苷B4 含量66.00%），PubChem CID：11636713，由英路维特医药科技有限公司惠赠，经江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心鉴定。

乳酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA双抗体夹心酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒，上海酶联生物。

1.3 方法

1.3.1 临床型乳房炎奶牛判断标准 试验奶牛均为自然感染，由牧场同一执业兽医判定，表现典型临床体征，入选标准如下：感染乳区乳汁SCC＞50 万/mL，患区红、肿，触之敏感、不安、躲避等，体温升高，乳腺肿大，泌乳量显著减少或停止，乳汁异常，呈浅黄色或浅红色，稀薄、粘稠或有絮状物[11-12]。

1.3.2 分组和给药 12 头健康奶牛记为对照组（不注射药物），12 头临床型乳房炎奶牛记为试验组（按0.05 mL/kg颈部肌肉注射白头翁皂苷B4，1 次/d，连续6 d），乳房炎发病当天记为第0天，观察临床疗效至第12天。

1.3.3 乳清采集和保存 每日08:00 于用药前分别采集各组奶牛第0、1、3、5、7、9、11 天乳汁。采样前温水清洗乳房，75%酒精消毒，弃去前3 把后采集10 mL 乳汁，5 mL 立即检测SCC，5 mL 在4 ℃下10 000 r/min 离心2次，30 min/次，充分脱脂，直至透明清亮，取上层乳清，-80 ℃冻存。

1.3.4 体细胞数和乳清因子检测 分别采用De Laval 乳汁体细胞检测仪和ELISA 法检测试验奶牛第0、1、3、5、7、9、11 天乳汁SCC 和乳清酶LDH、NAG、AST、ALT、ALP、ACP，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα，抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA含量。

1.4 数据分析与处理

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，K-S检验数据是否服从正态分布，各计量资料数据均采用平均值加减标准差（Mean±Standard Deviation）表示，组间采用独立样本t检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳汁体细胞数的影响

如表1所示，试验组临床型乳房炎奶牛乳汁SCC在0～7 d显著高于对照组（P＜0.05），随用药时间推移呈下降趋势，在0～7 d 显著下降（P＜0.05），7～11 d 无显著变化（P＞0.05），并在9、11 d 与对照组差异不显著（P＞0.05），表明白头翁皂苷B4可显著降低临床型乳房炎奶牛乳汁SCC。

表1 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳汁体细胞数的影响Tab.1 The effect of Pulsatilla saponin B4 on somatic cell count of milk in dairy cows with clinical mastitis

2.2 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清酶的影响

如表2 所示，临床型乳房炎奶牛乳清LDH 和NAG 在0～3 d 显著高于对照组（P＜0.05），AST 和ACP 在0～5 d 显著高于对照组（P＜0.05），ALT 在0～7 d 显著高于对照组（P＜0.05），ALP 在0～11 d 显著高于对照组（P＜0.05），随用药时间推移，各指标均呈下降趋势；其中LDH和NAG在5～11 d与对照组差异不显著（P＞0.05），AST和ACP在7～11 d与对照组差异不显著（P＞0.05），ALT在9～11 d与对照组差异不显著（P＞0.05），ALP 在用药后仍显著高于对照组（P＜0.05），但其含量显著低于发病初（P＜0.05），表明白头翁皂苷B4可显著促进临床型乳房炎奶牛乳酶恢复至健康水平。

表2 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清酶的影响Tab.2 The effect of Pulsatilla saponin B4 on enzymes activity of whey in dairy cows with clinical mastitis

2.3 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影响

如表3 所示，试验组临床型乳房炎奶牛乳清IL-1β 在0～5 d 显著高于对照组（P＜0.05），IL-6、IL-8 和TNF-α 在0～7 d 显著高于对照组（P＜0.05），随用药时间推移，各指标均呈下降趋势；其中IL-1β 在7～11 d与对照组差异不显著（P＞0.05），IL-6、IL-8 和TNF-α 在9～11 d 与对照组差异不显著（P＞0.05），表明白头翁皂苷B4可显著降低临床型乳房炎奶牛乳清炎性因子含量。

表3 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影响Tab.3 The effect of Pulsatilla saponin B4 on inflammatory factors of whey in dairy cows with clinical mastitis

2.4 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子的影响

如表4 所示，临床型乳房炎奶牛乳清T-AOC 和GSH-Px 在0～5 d 显著低于对照组（P＜0.05），CAT 和SOD 分别在0～3 d 和0～1 d 显著低于对照组（P＜0.05），随用药时间推移，各指标均呈上升趋势，其中TAOC 和GSH-Px 在7～11 d 与对照组差异不显著（P＞0.05），CAT 和SOD 分别在5～11 d 和3～11 d 与对照组差异不显著（P＞0.05）；MDA 含量在0～1 d 显著高于对照组（P＜0.05），随用药时间推移，呈下降趋势，在3～11 d 与对照组差异不显著（P＞0.05），表明白头翁皂苷B4 可显著升高临床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子含量，降低脂质过氧化物含量。

表4 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清抗氧能力的影响Tab.4 The effect of Pulsatilla saponins B4 on antioxidant index of whey in dairy cows with clinical mastitis

3 讨论与结论

3.1 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳汁体细胞和炎性因子的影响

奶牛乳汁SCC是指每毫升原乳含有的细胞总数，主要包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞以及脱落的乳腺上皮细胞等，它们共同参与乳房细胞免疫，其含量随乳房炎严重程度增加而升高，可作为奶牛临床型乳房炎早期诊断和疗效评估指标[13]。当奶牛发生乳房炎时，病原微生物刺激并激活其合成和分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子参与炎症反应，而炎性因子通过趋化作用，又吸引免疫细胞向炎症部位聚集，最终造成乳腺炎症相关因子过度表达，导致乳腺细胞损伤加剧[14]。本试验结果表明，临床型乳房炎奶牛乳汁SCC 和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 含量显著高于健康奶牛（P＜0.05），与资料报道一致[15]，可能是细菌感染损伤乳腺组织，使血管增强通透性，血液白细胞进入乳中，导致SCC 升高并产生大量的炎性因子引起炎症反应。研究发现中药可有效提高机体细胞免疫和体液免疫功能，减轻泌乳期奶牛炎症反应，降低乳汁SCC，提高奶牛生产性能和乳品质[16-17]。白头翁皂苷B4具有抗炎和免疫调节作用[18]，可显著降低中性粒细胞数量[19]，通过抑制炎症信号通路中相关蛋白表达，下调炎性因子含量，发挥抗炎作用[20]。本试验中，临床型乳房炎奶牛经白头翁皂苷B4治疗后，乳汁SCC、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量显著降低（P＜0.05），并最终接近正常水平，与上述学者研究结果一致，说明白头翁皂苷B4具有显著抗炎效果，通过降低促炎因子含量，减轻乳腺炎症反应，从而促进乳房恢复健康，而炎性因子的减少又抑制巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞向乳腺损伤部位趋化和募集，降低乳汁SCC，形成良性循环，最终恢复至健康水平。

3.2 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳酶的影响

奶牛乳酶参与乳汁产生和分泌，在乳腺先天性免疫和抗氧化过程中发挥重要作用，但当奶牛发生乳房炎时，其活性显著变化，因此乳酶活性对诊断奶牛乳房炎具有重要意义。其中LDH 和NAG 含量在乳房炎奶牛乳汁中显著升高，反映白细胞聚集过程和乳腺组织损害程度，可作为乳房炎早期诊断指标[4,21]，乳房炎牛乳中ALP 和ACP 含量随乳房炎严重程度增加而升高[22]，而AST 和ALT 在一定程度上可判断乳腺损伤和炎症感染程度[23]。本试验中，临床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT、ALP 和ACP 含量均显著高于健康奶牛（P＞0.05），与上述研究结果一致，乳房炎导致乳腺上皮细胞和血乳屏障受损，血液中酶直接进入乳中，同时体细胞中大量溶酶体发生溶解，进一步使乳中酶活性升高。而使用白头翁皂苷B4 治疗后，临床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT 和ACP 含量均呈下降趋势，并最终基本恢复至健康水平，与于文会等[24]和覃杰等[25]研究结果一致，白头翁皂苷B4 修复受损血管内皮细胞并增强中性粒细胞杀菌能力，抑制血液体细胞和溶酶体向乳汁转移[26]，并增强机体免疫功能[27]，促使奶牛乳酶恢复正常水平。

3.3 白头翁皂苷B4对临床型乳房炎奶牛乳清抗氧化能力的影响

炎症发展过程中，免疫细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除病原体，机体耗氧量增加并产生过量超氧阴离子（superoxide anion，）。当抗氧化能力不足以清除时，细胞发生氧化变化并诱导脂质过氧化，从而损害奶牛乳腺组织[28]。反映机体抗氧化功能指标主要有T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT和MDA 等，其中T-AOC 是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标，可判断机体氧化应激程度[29]。GSH-Px是重要的脂质过氧化物分解酶，可衡量机体抗氧化能力[30]。SOD和CAT可通过清除和过氧化氢等强氧化性物质，减缓氧自由基对细胞氧化损伤[31]。MDA 则是机体脂质受氧自由基攻击损害程度的重要指标之一[32]。本试验结果显示，临床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT含量显著低于健康奶牛（P＜0.05），MDA 显著高于对照组（P＜0.05），与尹柏双等[33]研究结果一致，可能是机体为对抗炎症反应，不断产生和过氧化氢杀灭病原菌，但氧自由基过多引起脂质过氧化反应，使抗氧化酶活性降低，造成组织细胞损伤，最终导致奶牛氧化-抗氧化失衡。研究表明白头翁、秦皮和杜仲混合提取物可提高麻鸭免疫功能和抗氧化能力[34]。白头翁及皂苷B4可提高T-AOC和SOD含量，降低MDA含量[35-36]。本试验中，白头翁皂苷B4 提高了临床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT 含量，降低MDA 含量，与He等[8]研究结果一致，可能是白头翁皂苷B4促进奶牛机体T-AOC 和SOD 将过多的转换为过氧化氢，并在GSH-Px 和CAT 作用下生成水和氧气，从而减轻机体和MDA 堆积，避免细胞受损，恢复抗氧化功能[37]。

白头翁皂苷B4可显著降低临床型乳房炎奶牛炎症反应和乳汁SCC，促进乳酶恢复正常水平，增强乳腺抗氧化能力，是治疗奶牛临床型乳房炎的理想药物。