李昊泽，石丽丽，曹学丽*，韩 天，裴海闰

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048）

发酵乳营养丰富，是必需氨基酸、蛋白质及钙元素的重要来源，有生长和发育调节价值[1-2]。研究表明，一些牛乳中包含生长因子和许多生物活性成分，可增强免疫系统功能并预防炎症[3-5]、促进心血管健康[6-7]，也可降低乳腺癌发病的概率[8]。除此以外，发酵乳还向功能性食品发展，如通过添加益生菌改善肠道功能，添加多元糖以改善健康状况等[9-11]。发酵乳已成为大众日常补充营养的普遍选择之一。

为了改善乳制品的风味和口感，乳制品中添加香精的情况十分普遍。乳制品中常用的香精种类很多，其构成成分复杂。由于香精的用量通常较低[12]，具有“自我限量”的特性，香精香料的安全性容易被忽视，但大量使用或接触某些香精成分存在安全风险。Morgan等[13]发现2,3-丁二酮的呼吸毒性，大鼠在6 h内持续暴露在203～352 mg/kg 2,3-丁二酮，会出现鼻上皮化脓性炎症和坏死的新情况。Andersen[14]发现，当苯甲醛在血液中质量浓度0.12 ng/mL时，小鼠的运动活力降低44%，兔子分别吸入500、750 mg/kg苯甲醛，会引起眼鼻刺激和死亡。Escobar-García等[15]发现即使在极低浓度（0.06 μmol/L），丁香酚也会对人牙髓成纤维细胞产生高毒性。Hironishi等[16]将原代小鼠海马神经元暴露于250 μmol/L及以上浓度的麦芽酚后，发生的介导凋亡现象证实麦芽酚的神经毒性。

有多种分析香精的方法，如直接溶剂萃取（direct solvent extraction，DSE）法[17-18]，其操作简单，但萃取得到的挥发性成分容易损失。同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）[19-21]、溶剂辅助风味蒸发（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）[22-24]、分子蒸馏（molecular distillation，MD）[25-26]法对挥发成分有较好的提取效果，但操作复杂、对仪器设备要求高。顶空-固相微萃取-气相色谱-串联质谱（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-tandem mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS/MS）[27-29]，操作简单、无需溶剂、效率高，因此广泛应用于风味物质分析。

GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[30]规定我国食用香料的使用标准，列出1 870 个允许使用的食品用途香料，其中天然香料393 个、合成香料1 477 个。除了婴儿配方食品中香兰素和乙基香兰素外，在所有允许添加香料的乳制品中，香料均可按生产需适量添加，并无限量规定。

本研究以风味发酵乳所含香精为研究对象，通过对乳制品常用香精的GC-MS/MS系统分析，结合毒理学数据筛选值得关注的香精成分；运用HS-SPME-GC-MS/MS定量分析市售风味发酵乳样品中香精关注成分，结合我国乳制品的实际消费情况，评估风味发酵乳中香精关注成分的暴露风险，以期为我国乳制品中香精安全风险评价体系的构建提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验样品

采购3 家知名乳制品公司采集乳制品中常用的12 家香精品牌的75 个香精样品，明细如表1所示，用于香精样品成分的定性分析及关注成分的筛选。分别超市采购与网购共11 家知名乳制品品牌26、27、18、5、8、10、6、5、1、3、1共110 个风味发酵乳样品后，3 ℃保存。

表1 乳制品常用香精品牌的样品明细Table 1 Application of 12 common brands of food flavors in three well-known brands of dairy products个

1.1.2 试剂

正构烷烃混合标准品（C7～C40，纯度99.5%）美国o2si公司；2,3-丁二酮（纯度＞99.0%）、(E)-2-己烯醛（98%）、乳酸乙酯（纯度＞99.0%）、正己醇（纯度＞99.5%）、己酸烯丙酯（98.0%）、苯甲醛（纯度＞99.5%）、芳樟醇（98.0%）、4-萜烯醇（98.0%）、苯甲酸乙酯（纯度＞99.5%）、乙酸苄酯（纯度＞99.7%）、菠萝酯（98%）、苯甲醇（纯度＞99.5%）、苯乙醇（纯度＞99.5%）、丁香酚（纯度＞99.5%），麦芽酚、乙基麦芽酚、邻氨基苯甲酸甲酯、香兰素、苯甲酸苄酯（纯度均为99.0%） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；正己烷、乙醇（纯度均为99.9%） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氯化钠（分析纯） 北京化工厂；高纯氦气、高纯氮气（纯度均为99.999%） 北京市氧利来科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C GC-MS/MS仪、DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、INNOWAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm） 美国Agilent公司；PC-420D固相微萃取平台 美国Corning公司；涡旋振荡器 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；电子分析天平 美国DENVER公司；移液枪 德国Eppendorf公司；SPME手动进样手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取头、100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取头 美国Supelco公司；15 mL固相微萃取样品瓶 上海安谱公司；磁力搅拌转子（1.5 cm，1.5 g） 北京半夏科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合标准液的配制

将19 个香精关注成分标准样品分别用乙醇溶液稀释到一定的浓度，其中固态标准品用乙醇溶液按一定浓度溶解，然后将19 个单标溶液配制成混标溶液，逐级稀释后，置于冰箱4 ℃贮存备用。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 香精样品分析前处理

取0.5 g香精样品于10 mL离心管内，加入5 mL正己烷溶液，盖上盖后，置于振荡器的中档模式振荡萃取10 min，待其静置分层后，取1 mL上相于另一装有无水硫酸钠的试管内，经无水硫酸钠脱水处理后，取1 μL脱水正己烷液于GC进样分析。

1.3.2.2 风味发酵乳样品分析前处理

提前将50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头在250 ℃的GC进样口老化至基线平稳。取5 g乳制品样品于15 mL SPME样品瓶内，并加入磁力搅拌转子，用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖盖紧后，用封口膜封住瓶口。设置SPME条件为萃取温度60 ℃、转速800 r/min。将准备好的样品瓶放置于样品盘，预热搅拌平衡10 min后，插入老化好的纤维萃取头，并保持纤维头离液面的距离约1.5 cm。保持60 ℃萃取50 min后，取出萃取纤维头，迅速插入250 ℃ GC-MS进样口，解吸5 min。

1.3.3 GC条件

1.3.3.1 香精成分定性分析条件

DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升温至150 ℃，再以6 ℃/min升温到230 ℃，保持5 min，共运行61.667 min。进样口温度250 ℃；载气高纯氦气；恒流模式，流速 1.0 mL/min；分流进样；溶剂延迟3 min。

1.3.3.2 风味发酵乳中香精关注成分定量分析条件

INNOWAX色谱柱（30 m×0.25 mm，5 μm）；升温程序：起始温度35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升温至95 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，最后以6 ℃/min升温到230 ℃，保持10 min，共运行64.667 min。进样口温度250 ℃；载气高纯氦气；恒流模式，流速1.0 mL/min；不分流进样。

1.3.4 MS条件

电子电离源；离子源温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；辅助加热区温度250 ℃；电子能量70 eV；无溶剂延迟。香精成分定性分析采用选择性扫描模式，质量扫描范围m/z29～300；风味发酵乳中香精关注成分定量分析采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.3.5 定性方法

1.3.5.1 谱库检索

首先使用Mass Hunter Analysis Qualitative软件及其谱库（NIST11.LIB），对各色谱峰进行定性。选择峰形较好、分离度好且信噪比大于3的色谱峰，再对色谱峰提取相应的质谱图，最后将质谱图结果与谱库相匹配，选择匹配度大于80的结果，记录匹配度靠前的物质，作为色谱峰初步定性的依据。

1.3.5.2 保留指数（retention index，RI）定性

将稀释到合适浓度的C7～C40正构烷烃标准品，采用与香精样品相同条件进行分析，测定各正构烷烃的保留时间。按下式计算每个物质的RI：

式中：n和n+1分别为未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间/min；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间/min；tn＜t＜tn+1。

2 结果与分析

2.1 乳制品常用香精的成分分析及关注成分的筛选

2.1.1 乳制品常用香精的成分分析

在75 个香精样品中，共鉴定148 个香精成分，结果如图1所示，酯类和醇类化合物占一半。检出率大于20%的化合物中，其大小关系为丙二醇（77.33%）＞丁酸乙酯（57.33%）＞顺-3-己烯-1-醇（53.33%）＞乙酸乙酯（45.33%）＞芳樟醇（42.67%）＞香兰素（41.33%）＞乙酸叶醇酯（37.33%）＝(+)-柠檬烯（37.33%）＝乙醇（37.33%）＞乙酸己酯（36.00%）＞丙内癸内酯（33.33%）＞正己醇（32.00%）＞苯甲醛丙二醇缩醛（30.67%）＝正己酸乙酯（30.67%）＞苯甲醛（29.33%）＞乙酸异戊酯（28.00%）＞α-松油醇（26.67%）＞丙位十一内酯（24.00%）＝三醋精（24.00%）＝2-甲基丁酸乙酯（24.00%）＞苯甲醇（22.67%）＝乙酸苄酯（22.67%）＞乙基麦芽酚（21.33%）＝β-紫罗酮（21.33%）＝香叶醇（21.33%）。由于在筛选香精样品内化学成分时，大部分丙二醇作溶剂的样品检测后有很大的溶剂峰，或溶剂峰不明显时有很大的乙醇溶剂峰，二者检出率较高的原因为丙二醇是水溶性香精溶剂，乙醇为香精中助溶剂，二者在香精中含量较高，且丙二醇、乙醇的毒性均较低，因此并不将其作为关注成分。

图1 75 个香精样品中化合物成分的种类及数目Fig.1 Chemical composition of 75 flavor samples

2.1.2 香精关注成分的筛选

基于美国毒理学数据网络（toxicology data network，TOXNET，https://www.nlm.nih.gov/toxnet/index.html）的有害物质数据库（hazardous substances data bank，HSDB）寻找对应香精化合物成分对应的LD50。筛选过程参考GB 15193.3—2014《急性经口毒性试验》[31]的急性毒性（median lethal dose，LD50）剂量分级标准，以LD50低于3 000为筛选的基本依据，并按照以下3 个条件进行筛选：1）检出率高于10%且LD50低于3 000的成分共12 个：芳樟醇、香兰素、正己醇、苯甲醛、苯甲醇、乙酸苄酯、乙基麦芽酚、麦芽酚、苯乙醇、乳酸乙酯、反-2-己烯醛、4-萜烯醇；2）检出率低于10%，但相对含量高于1%的次数占出现总数的半数及以上，且LD50低于3 000的成分共4 个：己酸烯丙酯、菠萝酯、苯甲酸乙酯、丁香酚；3）检出率小于10%，但在同类香精中，其出现次数占同类香精总数的半数及以上，且LD50低于3 000的成分共3 个：2,3-丁二酮、苯甲酸苄酯、邻氨基苯甲酸甲酯。共筛选得到19 个关注成分，其保留时间、RI、参考保留指数（reference retention index，Ref RI）如表2所示。

表2 19 个香精关注成分信息Table 2 Information about 19 flavor substances of concern

2.2 市售风味发酵乳中香精关注成分的定量分析

2.2.1 香精关注成分GC-MS/MS MRM参数优化

取合适浓度的混合标准品溶液进样后，首先在选择性扫描模式19 个关注成分质谱图中丰度最高的离子为母离子，然后对这19 个母离子进行产物离子扫描，且在碰撞电压5～30 V进行优化，每个母离子中选择2 个最优的子离子组成2 个离子对。19 个关注成分的保留时间、离子对及碰撞电压如表3所示。19 个关注成分的混合标准溶液及典型样品经HS-SPME法萃取后在优化参数条件与MRM模式的离子流色谱图如图2所示。

图2 19 个关注成分在MRM模式的总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatogram of 19 flavor substances of concern in MRM mode

表3 MRM模式的19 个香精关注成分参数设置Table 3 Parameter settings for analysis of 19 flavor substances of concern in the MRM mode

2.2.2 风味发酵乳样品前处理条件优化

对比3 种SPME萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、100 μm PDMS，优化萃取时间（30、40、50、60、70、80 min）、萃取温度（40、50、60、70、80 ℃）、NaCl添加质量等条件，以峰面积总和为考察指标，最终确定HS-SPME前处理的最优萃取条件如下：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头，萃取温度60 ℃，萃取时间50 min，无氯化钠。

2.2.3 HS-SPME-GC-MS/MS的方法学评价

2.2.3.1 方法的精密度

配制不同质量浓度19 种关注成分的混合标品溶液，加入到空白基质当中，按照前述的HS-SPME前处理条件GC-MS/MS分析方法进行测定，得出19 种关注成分在HSSPME-GC-MS/MS条件的标准曲线方程、相关系数、线性范围、3 倍信噪比检出限（limit of detection，LOD）、10 倍信噪比定量限（limit of quantitation，LOQ）、日内精密度（24 h内连续3 次进样测定的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD））和日间精密度（连续3 d测定的RSD），如表4所示。

表4 HS-SPME-GC-MS/MS法的精密度Table 4 Analytical figures of merit of HS-SPME-GC-MS/MS for analysis of 19 flavor substances of concern

2.2.3.2 方法的回收率

选择本底较干净的发酵乳样品用于加样回收实验，向样品中分别添加3 个不同质量浓度梯度的19 种关注成分的混合标准品溶液（高、中、低质量浓度），采用优化HS-SPME-GC-MS/MS条件进行测定。结果如表5所示。

表5 HS-SPME-GC-MS/MS分析19 种关注成分的回收率Table 5 Recoveries of 19 flavor substances of concern by HS-SPME-GC-MS/MS

2.2.4 风味发酵乳样品中关注成分的定量分析

采用上述优化好的HS-SPME-GC-MS/MS方法，对110 个风味发酵乳样品进行19 个关注成分进行定量分析，结果见表6。19 个关注成分中，检出率最高的为2,3-丁二酮和苯甲醛，二者均为100%。2,3-丁二酮具有新鲜的乳香特征，乳制品香精中广泛存在。乳酸菌发酵过程中也会产生一定的2,3-丁二酮，其也是发酵乳的主要风味物质。另外，苯甲醛也是牛（羊）乳本身含有的成分。但本研究发现，风味发酵乳样品中这2 个物质的含量远高于原味发酵乳或纯牛奶，因此说明风味发酵乳样品中这2 种成分的存在与香精的添加密切相关，值得关注。此外检出率大于90%的还有4 个物质，其大小关系为麦芽酚（98.2%）＞乙基麦芽酚（96.4%）＞正己醇（95.5%）＞苯乙醇（90.0%）。19 个关注成分中，平均含量大于1 000 μg/kg的有6 个，其大小关系为乙基麦芽酚（6 306.08 μg/kg）＞香兰素（5 004.22 μg/kg）＞2,3-丁二酮（2 258.90 μg/kg）＞乳酸乙酯（1 300.80 μg/kg）＞苯甲醇（1 210.60 μg/kg）＞麦芽酚（1 072.04 μg/kg）。从定量结果可知，香精成分在不同的样品中含量差异很大，即使在相同口味的样品，不同品牌之间也存在很大的差异。

表6 110 种风味发酵乳样品中19 个关注成分的定量分析结果Table 6 Results of determination of 19 flavor substances of concern in 110 samples of flavor fermented dairy products

2.3 风味发酵乳中香精关注成分的暴露风险评估

由于毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）法的广泛应用[32-34]，本实验根据More[34]和刘静[35]等的方法计算香精关注成分的人均日摄入量（per capita daily intake，PCI）。根据欧盟的化学污染物暴露评估的人群分组模式和中国居民营养与健康状况调查报告，得到的不同人群的平均体质量及每人每日乳制品的消费量见表7[35]，此处乳制品均以风味发酵乳计。

表7 年龄分组、平均体质量、乳制品日消费量[35]Table 7 Average body mass and daily consumption of dairy products in different age groups

各关注成分在不同人群的最大PCI与TTC的对比结果如表8所示。绝大部分关注成分在各人群的最大PCI均小于或远小于TTC，说明无暴露安全风险。但2,3-丁二酮和香兰素在1～3 岁儿童中分别有0.9%和4.1%的超出率，乙基麦芽酚在所有消费人群中均有超出，而且在儿童1～3 岁消费人群的超出率最高（15%），为其他消费人群的2 倍左右，因此乙基麦芽酚对所有人群均存在一定的暴露风险。同时，相对于其他人群，1～3 岁儿童对所有香精成分的暴露风险显著高于其他人群，1～3 岁儿童的暴露风险应引起关注。不过更确切的风险评估需准确调查风味发酵乳摄入量。

表8 不同消费人群的最大PCI与TTC的比较Table 8 Comparison of maximum PCI in different age groups of consumers with TTC

3 结 论

本实验通过对常用乳制品香精样品的GC-MS系统分析，以毒理学数据LD50低于3 000为基本条件，结合检出率、相对含量及同类香精的高检出率共性成分3 方面的筛选，共筛选19 个香精关注成分。采用HS-SPME-GCMS/MS（MRM模式）对市售风味发酵乳进行大样本量定量分析的结果表明，19 个关注成分中检出率最高的为2,3-丁二酮和苯甲醛，均为100%。此外检出率大于90%的还有4 个，其大小关系为麦芽酚（98.2%）＞乙基麦芽酚（96.4%）＞正己醇（95.5%）＞苯乙醇（90.0%）。19 个关注成分中，平均含量大于1 000 μg/kg的有6 个，其大小关系为乙基麦芽酚（6 306.08 μg/kg）＞香兰素（5 004.22 μg/kg）＞2,3-丁二酮（2 258.90 μg/kg）＞乳酸乙酯（1 300.80 μg/kg）＞苯甲醇（1 210.60 μg/kg）＞麦芽酚（1 072.04 μg/kg）。基于毒理学关注阈值的风险评估提示，乙基麦芽酚在所有消费人群中均有超出阈值的情况，而且在儿童1～3 岁消费人群的超出率最高（15%），是其他消费人群的2 倍左右，因此乙基麦芽酚对所有人群存在一定的暴露风险，相对于其他人群，1～3 岁儿童对多数香精成分的暴露风险显著高于其他人群，应引起关注。