王友强 兰由玉 李世勇 黄晓玲

(1.西南医科大学附属中医医院检验科，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院风湿免疫科，四川 泸州 646000)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是最普遍的自身免疫性疾病之一，可影响手足的小关节，引起患者关节疼痛、肿胀及僵硬，并逐渐导致患者关节功能障碍及残疾[1]。成纤维样滑膜细胞(FLS)是构成滑膜内膜结构的主要细胞类型，滑膜内膜结构是RA发展和进程中的决定性因素之一，FLS参与RA的炎症和关节破坏，且炎症的发生是导致关节和骨骼进行性损伤的主要原因[2-3]。CCR5是一种G蛋白偶联受体(GPCR)，CCR5与其相应的配体结合后可通过调节WBC的活化和定向迁移来调控免疫炎症反应[4-5]。已有研究发现CCR5参与了包括RA、骨质疏松症在内的多种疾病的发病机制[6-7]。滑膜T细胞中的CCR5水平升高，并与RA的发生发展有关[8]，但关于CCR5具体的作用机制研究目前报道甚少。因此，本研究拟通过RNA干扰技术抑制RA大鼠中CCR5的表达，以探讨沉默CCR5对RA大鼠滑膜细胞炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠30只，体重(170±6)g，购买于西南医科大学实验动物中心，实验通过了西南医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 实验材料 脂质体Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen公司)，弗氏完全佐剂(CFA)(美国Sigma公司)，Trizol Reagent(日本Takara公司)，逆转录试剂盒(美国Promega公司)，大鼠TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 ELISA试剂盒(上海吉泰依科赛生物科技有限公司)，CCR5抗体(英国Abcam公司)，二抗(兔抗羊IgG)(英国Abcam公司)，PCR试剂盒(日本Takara公司)，CCR5 siRNA(3条)和NC siRNA(1条)序列由GeneChem公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA载体构建 将事先设计好的大鼠CCR5 siRNA(3条)和NC siRNA(1条)序列(见表1)经处理后构建成pU6-siRNA-GFP载体(均由GeneChem公司完成)，再通过Lipofectamine 2000将载体转入大鼠滑膜细胞，操作按照说明书进行。……