李健，何鹏飞，李咏梅，吴毅歆，何鹏搏， 孔宝华，李兴玉，MUNIR Shahzad,何月秋

1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201； 2.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)广泛存在，且较安全[1]，其发酵产品易于运输贮藏、货架期长，是目前注册并商业化生产使用最多的生防菌剂[2]，在替代或减少化学农药使用、保护环境、维护生态平衡、物种多样性和农业可持续发展中发挥着越来越重要的作用[3]，如植物病害防治[4]、植物促生长[5-6]、采后果实病害防控及保鲜[7]等方面，均有报道。枯草芽孢杆菌L1-21(下称L1-21)是一株来自温州蜜柑“新津”品种的内生菌，它对柑橘黄龙病菌有较好的抑制效果[8]，对多种常见病原细菌及真菌都有显著抑菌活性，且能定殖于多种作物体内[9]，应用潜力巨大。为了更好地在田间应用该菌株并为施用方法提供理论依据，笔者开展了枯草芽孢杆菌L1-21进入柑橘叶片、果实的速度及其防治果实绿霉病效果的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养基

供试菌株为L1-21的绿色荧光标记菌株L1-21-GFP，来自笔者所在实验室。该菌株荧光标记稳定性好，生长速度和代谢特性及防控病害能力与野生型相同。绿霉病病原菌(Penicilliumdigitatum)为实验室自主分离并保存。柑橘植株为温州蜜柑“新津”，生长于大棚温室。柑橘果实品种为新津、砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙,均购于农贸市场。

L1-21-GFP培养于LB液体和固体培养基，绿霉病菌培养于马铃薯蔗糖液体(PS)和固体培养基(PSA)。

1.2 L1-21-GFP的培养

从-80 ℃冰箱取出L1-21-GFP甘油保存菌，待其呈熔融状态后，划线接种到含氯霉素(终质量浓度为10 μg/mL，下同)的LB琼脂培养基平板中，37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落于三角瓶中，在35 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d，在含有氯霉素的LB琼脂平板上培养并确定培养液中细菌浓度。

1.3 L1-21-GFP进入叶片时间与定殖量测定

将L1-21-GFP菌株浓度调至106cfu/mL，晴天下午18:30喷施于柑橘植株叶片，接种量以叶面无液滴下滑为度。分别于全株喷施结束后的10 min、20 min、30 min、40 min、1 h、4 h、6 h、8 h、18 h、22 h以及48 h，每次随机采集3片叶。按采样时间分别装入保鲜袋中，立即放入4 ℃冰箱贮存或放置冰上。实验室内用千分之一的分析天平称量出叶片的质量，在A4白纸上临摹叶片，在叶片形状中标注编号，剪下叶片留下的形态，称量纸片质量，按照A4纸单位质量面积(142.85 cm2/g),计算出叶片面积(S)，并做好数据的记录。对于各时间段所采集的叶片，用3 mL的无菌水漂洗，回收漂洗液后按10倍梯度稀释，取200 μL漂洗稀释液在含有氯霉素的LB琼脂培养基平板上涂布。37 ℃培养24 h后统计平板上的菌落数，计算出菌体的单位叶面积浓度(cfu/cm2)。

将上述使用无菌水漂洗过表面的柑橘叶片置于1%(有效氯)NaClO溶液中消毒2 min、75%乙醇溶液中消毒2 min以杀死叶表微生物。无菌水漂洗4次，用无菌吸水纸吸干表面残余水分，转移至无菌研钵内。按照叶片质量加入无菌水，仔细研磨成匀浆状，按10倍梯度稀释，随后取200 μL叶肉组织研磨稀释液，在含有氯霉素的LB琼脂培养基平板上涂布，37 ℃培养24 h后统计平板上的菌落数，计算出菌体在叶肉内的单位面积浓度(cfu/cm2)。

1.4 L1-21-GFP在柑橘植株上向下传导能力测定

喷施3株树(3重复)，每株顶部单梢喷施约10片叶，并做好记录，用报纸和纸袋(塑料袋)包裹其他叶片，以防被污染。分别于单梢喷施结束后的1、2、8、16、22、30 h，每株树上、中、下各取1片未喷施的叶片，余下操作步骤同本文“1.3”。

1.5 L1-21-GFP在柑橘果实内的定殖试验

1)L1-21-GFP在本主寄主果实中的定殖试验。L1-21-GFP的培养方法同本文“1.2”一致，浓度调整为108cfu/mL，选择大小适宜、色泽均匀的新津柑橘果实，自来水冲洗表面2 min后用吸水纸吸干，用75%乙醇消毒2 min后无菌水漂洗4次，并用无菌滤纸吸干，分别喷施菌液及浸泡L1-21-GFP处理1、5和10 h，取出后，用无菌滤纸吸干，无菌下各称取1 g果皮和果肉，分别加入9 mL无菌水研磨成匀浆，按10倍梯度稀释，取200 μL稀释液涂布于含有氯霉素的LB琼脂培养基平板上,余下操作步骤同本文“1.3”。试验进行3次重复，每次重复使用18个果实，计算菌含量。

2)L1-21-GFP在不同品种柑橘果皮及果肉内的定殖。所选品种为砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙，果实的消毒处理同本文“1.5 1)”，L1-21-GFP浓度为108cfu/mL，果实浸泡30 min后取出放置于37 ℃培养箱，并在培养后的6、24及48 h于无菌条件下分离果皮及果肉，余下步骤同本文“1.5 1)”。

1.6 L1-21-GFP对绿霉病的防效测定

选用砂糖橘果实按本文“1.5”消毒及浸泡，L1-21-GFP浓度为108cfu/mL，果实浸泡30 min后取出，并在其赤道附近用针刺法刺一直径约3 mm、深度约5 mm的小洞，接入20 μL绿霉病菌孢子液，浓度为102cfu/mL，放入25 ℃恒温培养箱培养，在处理后3 d和5 d时统计果实发病率，并计算防效，以浸泡液体LB的果实为对照，3次重复，每个重复90个果实。

1.7 数据处理与分析

L1-21-GFP的定殖数据用Excel及IBM SPSS Statistics 20.0软件做统计分析，采用 Duncan’s 新复极差法进行多重比较(P<0.05)，用GraphPad Prism 制图。

2 结果与分析

2.1 L1-21-GFP进入叶片时间与定殖量

整体来看(表1)，L1-21-GFP的定殖数量呈现逐渐增长的趋势。叶肉中的定殖数量从10 min到48 h逐渐增加，10 min在叶肉内定殖数量为8.08×102cfu/cm2，48 h时定殖数量达到1.43×104cfu/cm2；L1-21-GFP在叶表的定殖呈现先增加后降低再增加后趋于稳定的趋势，从10 min到40 min菌含量逐渐增加，10 min时定殖量为1.36×103cfu/cm2，1 h时其定殖量降低为1.81×103cfu/cm2，随后逐渐增加，到8 h时定殖量达1.97×104cfu/cm2，18 h时虽有降低，但其菌含量亦达到1.39×104cfu/cm2，至22～48 h，定殖量变化不大。

表1 叶片中L1-21-GFP的定殖数量 Table 1 Colonization number of L1-21-GFP in leaves cfu/cm2

2.2 L1-21-GFP在柑橘植株上向下的传导能力

顶部单梢喷施，检测下部未喷施的叶片，结果显示L1-21-GFP在叶表中的定殖量变化较为平稳(表2)，其范围在1.51×102cfu/cm2(1 h)到4.29×102cfu/cm2(2 h)之间；在叶肉中，1 h取样时，L1-21-GFP的定殖量为0，从2 h到30 h，定殖量逐渐增加，30 h定殖量达到1.15×103cfu/cm2。

表2 L1-21-GFP向下传导到叶片的数量 Table 2 The number of L1-21-GFP transmitted downward to leaves cfu/cm2

2.3 L1-21-GFP在柑橘果实内的定殖量

1)L1-21-GFP在本主寄主果实中的定殖量。L1-21来自早熟温州蜜柑品种新津(本主寄主)。喷施及浸泡新津果实处理证明L1-21-GFP能在新津果实内定殖(表3)；在喷施处理下于不同时间段取样，L1-21-GFP在果皮中比果肉中的定殖量高，但各自在3个时间段里无显著差异。在浸泡处理中，果皮中菌量大于果肉。在1 h后L1-21-GFP在果皮内和果肉中的定殖量分别为3.51×104cfu/g和9.51×103cfu/g，与浸泡5 h及10 h处理果实无显著性差异，即处理果实浸泡1 h，L1-21-GFP菌量达到每克组织103～104cfu。

表3 L1-21-GFP在新津果皮及果肉内的定殖数量 Table 3 Colonization number of L1-21-GFPin peel and pulp of Citrus cv Xinjin

2)L1-21-GFP在不同品种柑橘果皮及果肉内的定殖量。采用不同品种的柑橘果实浸泡30 min，取出置于37 ℃温箱培养，在6、24及48 h检测果皮及果肉内L1-21-GFP的含量的结果(表4)显示：L1-21-GFP均能在不同柑橘品种果实内定殖，但是不同品种间，其定殖能力存在差异；在培养6～48 h，L1-21-GFP在椪柑果皮中定殖量最高，达到3.67×103～2.03×104cfu/g，其次是砂糖橘2.22×103～1.88×104cfu/g；总体上随着培养时间延长，定殖的菌量有所增加，但至24 h后，果肉中的定殖量略高于48 h，但差异未达显著水平。

表4 L1-21-GFP在不同柑橘果实中的定殖数量 Table 4 Colonization number of L1-21-GFP in different Citrus varieties fruits 102 cfu/g

3)L1-21-GFP对绿霉病的防效。先接种L1-21后接种绿霉菌，3 d和5 d时统计防效结果(表5)。由表5可见，处理3 d后，空白对照81.67%果实显症，已出现少量绿霉，而以L1-21-GFP处理的果实未出现绿霉症状，防效100%；处理5 d后，空白对照96.39%果实显症，以L1-21-GFP处理的果实18.88%显症，防效达80.36%。本结果是依据果实发病率(图1)来计算的，如果按发病面积来计算，所得到的防效应该更高。

表5 L1-21-GFP防治柑橘果实绿霉病的效果 Table 5 Control effect of L1-21-GFP on citrus green mold %

A.处理组3 d； B.对照组3 d； C.处理组5 d； D.对照组5 d。A.Treatment after 3 d; B.Negative control after 3 d; C.Treatment after 5 d; D.Negative control after 5 d.

3 讨 论

枯草芽孢杆菌作为一种重要的生防资源，可在植物根际土壤、根系及地上部组织等多个位置定殖。殷幼平等[10]研究结果表明喷施后立即测定，CQBS03-p HY43G在柑橘叶片上的定殖数量最高为6.80×104cfu/g，而后从0 d到42 d菌株定殖量逐渐下降；为有效排除其他细菌对枯草芽孢杆菌L1-21定殖计数结果的干扰，本研究选用了106cfu/mL浓度的枯草芽孢杆菌L1-21的绿色荧光标记菌株，结果证明该菌株可迅速在柑橘叶片内定殖，10 min定殖量分别为1.36×103cfu/cm2(叶表)和8.08×102cfu/cm2(叶肉)，究其原因一方面可能是L1-21菌株作为柑橘内生细菌，与寄主植物有天然的良好互作共生关系，与异源寄主内生菌相比，宿主内生细菌的快速定殖易于其抢占有利的生态位点，为发挥高效的生防作用奠定基础；另一方面喷施接种时间为晴天傍晚18：30，菌株受到温度、湿度、紫外线等环境因素变化的影响较小，这可为指导田间的使用提供依据。不同于殷幼平等[10]的报道，我们发现L1-21在柑橘叶片上呈现持续增长的趋势，如48 h定殖数量是10 min的17.69倍(叶肉)和19.71倍(叶表)，这或许与取样时间长短及菌株本身的定殖特性有关。叶肉中L1-21定殖量稳定增长的趋势说明叶肉更适合其定殖，而叶表中18 h出现降幅可能与接种后次日白天所受环境因素的变化有关[11]。金勤等[12]在油茶上通过叶部喷施Y13UV-GFP菌悬液，发现Y13UV具有向下传导的能力。本次顶部单梢喷施试验中，也得出相同的结论。另外，L1-21-GFP向下传导到叶表的定殖量趋于稳定，暗示其对叶表复杂的微环境有较强的适应性，而传导到叶肉后所呈现的菌含量不断增加的趋势，则可能与其在叶肉内的生长繁殖有关。但L1-21-GFP传导到叶表及叶肉内的定殖数量较低，或许与低接种量(106cfu/mL)及其在柑橘叶面上的润湿、黏附、渗透等有关。因此田间使用时，建议提高L1-21的接种浓度，并辅以适量的表面活性剂，降低喷雾液滴的表面张力，充分润展，延长其在柑橘叶片上的保湿及滞留时间[13]，以进一步提升菌株的叶片定殖能力。

基于安全性及对果实品质的延续性，枯草芽孢杆菌作为公认的食品工业中应用的安全微生物[14]，被逐渐应用于采后果实的保鲜及病害防控[15-16]。直接浸泡油桃果实的试验结果显示枯草芽孢杆菌BS-331可显著抑制油桃果实采后病害的发生，且其防效与纳他霉素(300 mg/L)相当[17]。陈欣怡等[18]用枯草芽孢杆菌9407菌悬液浸泡苹果，发现菌株能在果实内部定殖，但近表皮处果肉中的定殖量显著高于近果心果肉中的定殖量。本研究也证实L1-21不仅能定殖于来源寄主(本主)新津，还能在其他柑橘品种上定殖，显示出良好的应用潜力。其中在浸泡处理0.5 h后，L1-21的定殖能力更强。此外，研究还发现L1-21在果皮内的定殖能力优于果肉。整体来看(表4)，柑橘浸泡后的6～24 h是生防芽孢杆菌L1-21菌株在果皮中的急速生长期：24 h定殖量与6 h相比，砂糖橘增长5.23倍，塘房橘增长4.16倍，椪柑增长3.63倍，清香橘增长3.29倍，沃柑增长1.48倍。L1-21在不同果实内定殖能力的差异，或许与品种本身的形态及生理生化等特征(果皮厚度、果皮细胞间隙及果肉含糖量等)相关。

最近，L1-21菌株被证实可有效防治番茄采后病害——灰霉病[7]，更早时有利用解淀粉芽孢杆菌DH-4成功防治柑橘采后病害——绿霉病的成功报道[19]。在本研究中，L1-21-GFP对柑橘绿霉病菌的平板抑菌圈直径为37.02 mm(结果未列出)，浸泡处理果实30 min，注射接种绿霉病菌孢子和只记录发病率的条件下，该菌株对果实绿霉病的防效3 d为100%、5 d为80.36%，说明L1-21对柑橘果实绿霉病的防控也有着广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌L1-21是一株能高效抑制柑橘黄龙病的柑橘内生细菌，本研究结果对拓展其应用范围、田间应用技术方法及应用前景具有指导意义，但大田条件下的菌体细胞定殖量对黄龙病的防效以及后续贮藏期果实绿霉病发生之间的关联性还有待进一步证实。