卢东红 姜海行 胡榜利 周 霞 陶 霖 卢东诚 阮仙仙

(广西医科大学第一附属医院消化内科，广西南宁市 530021)

肝纤维化是各种慢性致病因素所致慢性肝损伤后，由于组织发生修复反应时外基质合成、降解和沉积不平衡而引起的病理过程。辅助性T细胞22(T helper cells 22,Th22) 是新发现的效应CD4+T 细胞亚群，参与多种免疫疾病的发生发展，它为治疗慢性皮肤炎症以及哮喘等提供了新的思路。有研究发现微小RNA-200a(micro RNA-200a，miR-200a)在肝纤维化、肝硬化及肝癌中的表达下调，但关于miR-200a与Th22细胞相互关系的报道甚少。本研究通过建立四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导肝纤维化模型，并检测肝纤维化小鼠脾脏Th22 细胞表达水平及肝纤维化小鼠肝组织IL-22和miR-200a的表达量，初步探讨Th22细胞及miR-200a在肝纤维化发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 无特定病原体的雄性BALB/c小鼠(8周龄)，体重约25 g，由广西医科大学实验动物中心提供；CCl4和橄榄油购自上海国药集团化学试剂有限公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国 GIBCO 公司；乙酸肉豆蔻佛波醇和离子霉素购自美国Sigma公司；大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体购自美国 BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的建立 将40只雄性BALB/c小鼠按随机数字表法分为对照组和模型组，每组20只。采用CCl4腹腔注射法建立小鼠肝纤维化模型。对照组腹腔内注射橄榄油，2 mg/kg，2次/周；模型组腹腔内注射CCl4溶液(橄榄油配制)，浓度20%，2 mg/kg，2次/周。两组小鼠分别于8周后处死， 留取脾和肝脏。

1.2.2 肝组织HE和Masson染色 取肝脏后立即放入4%甲醛溶液中固定，24 h内制成蜡块。蜡块切片，常规HE和Masson染色，光学显微镜下观察。

1.2.3 肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白表达的检测 采用免疫组化SP法：切片、脱蜡、水化、抗原修复、一抗4 ℃过夜、二抗温育、DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检。使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统半定量测定α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，计算平均光密度值，取同一标本三张切片测量值的均值。

1.2.4 流式细胞术检测小鼠脾脏 Th22细胞 取下小鼠脾脏置于PBS缓冲液中剪碎、研磨，制成脾单细胞悬液。用红细胞裂解液裂解红细胞，用RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清)调整淋巴细胞浓度为1×106/mL，以24孔板作培养载体，加入PMA(25 ng/mL)、离子霉素 (1 μg/mL)和蛋白质转运抑制剂 (1.7 μg/mL)，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育5 h。收集细胞，进行细胞表面CD4分子染色，破膜剂破膜后加AF488-IFN-γ抗体、APC-IL-17抗体和PE-IL-22抗体，向相应对照管内加同型对照抗体，4 ℃避光孵育30 min，用1%多聚甲醛避光固定，24 h内用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。结果采用Flowjo 7.6.1软件进行分析。IL-22+IL-17-IFN-γ-CD4+定义为Th22细胞。

1.2.5 RT-PCR检测肝组织IL-22和miR-200a mRNA的表达 肝脏组织取材后保存于-80 ℃冰箱。以TRIZOL试剂提取肝组织总RNA，应用逆转录试剂盒合成cDNA，放-20 ℃冰箱保存。实时荧光定量PCR扩增IL-22和miR-200a mRNA，以β-肌动蛋白作为内参照基因。IL-22引物序列：F-CGA TTG GGG AAC TGG ACC TG，R-GGA CGT TAG CTT CTC ACT TT；miR-200a引物序列：F-CCT ACG CCA CCA TTA ACA AGC C，R-GCC GTC TAA CAC TGT CTG GTA；β-肌动蛋白引物序列：F-AAT TCC ATC ATG AAG TGT GA，R-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC。所有数据应用2-△△Ct相对定量分析法，三个复孔求得平均值。

2 结 果

2.1 肝纤维化小鼠模型的建立情况 HE染色镜下所见：对照组肝小叶结构正常，无变性、坏死；模型组肝细胞索排列紊乱，胶原纤维增生，肝小叶结构破坏，假小叶形成。 模型组Masson染色所见与HE染色中纤维化基本一致，纤维沉积显色为淡绿色，提示肝纤维化模型成功建立(图1)。

图1 两组小鼠肝脏HE和Masson染色(×400)

2.2 肝脏组织中α-SMA的表达 两组小鼠的肝组织可见α-SMA大量表达(图2)，模型组的α-SMA表达(0.48±0.02)明显高于对照组(0.08±0.01)，差异有统计学意义(t=76.461，P<0.001)。

图2 两组小鼠肝组织α-SMA免疫组织化学染色(×400)

2.3 小鼠脾脏的Th22细胞亚群比例 两组小鼠的Th22细胞亚群比例明显升高(图3)，模型组的小鼠脾脏Th22细胞亚群比例(12.83±1.04)高于对照组(1.98±0.05)，差异有统计学意义(t=46.740，P<0.001)。

图3 两组小鼠Th22细胞代表性的图像

2.4 RT-PCR检测肝组织IL-22和miR-200a mRNA的表达 模型组小鼠肝脏IL-22 mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠肝脏miR-200a mRNA相对表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组小鼠肝组织IL-22、miR-200a mRNA 的表达 ()

3 讨 论

肝纤维化是继发于各种慢性致病因素(如病毒性肝炎、酒精性肝病、某些代谢性疾病等)引起的肝脏损伤和炎症后组织修复过程中的代偿反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变，其主要以细胞外基质的过度产生和沉积为特点。本研究采用CCl4建立肝纤维化模型，HE及Masson染色显示模型组的肝细胞索排列紊乱，胶原纤维增生，肝小叶结构破坏，假小叶形成；模型组肝组织α-SMA的表达明显高于对照组(P<0.05)。提示本研究采用CCl4建立肝纤维化模型成功。

Th22细胞属于CD4+T细胞功能亚群，表达CCR6、CCR4和CCR10，分泌IL-22和TNF-α，不分泌IFN-γ、IL-4、IL-17，是独立于Th1、Th2和Th17的细胞亚群。Th22细胞参与了自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生发展过程，例如在银屑病[1]、狼疮性肾炎[2]、病毒性心肌炎[3]、幽门螺杆菌相关胃疾病[4]、药物性肝炎[5]及急性肝衰竭[6]中发挥重要的作用。我们前期对Th22细胞及其效应因子IL-22在肝纤维化发生作用机制的研究发现：乙型肝炎(乙肝)肝纤维化患者外周血Th22细胞占CD4+淋巴细胞比例明显高于慢性乙肝患者和健康对照人群；乙肝肝纤维化患者CCR4+Th22、CCR6+Th22、CCR10+Th22细胞占Th22细胞比例显著高于慢性乙肝患者和健康对照人群。Th22主要分泌 IL-22，这是一种特殊的免疫调节因子，属于白介素10家族细胞因子。 IL-22参与多种疾病的病理生理过程，它通过受体激活下游信号通路发挥生物学作用。IL-22的受体复合物是IL-10R2与IL-22R1构成的异源二聚体，IL-22与其受体结合后，激活JAK/STAT通路，通过STAT3活化发挥作用。我们前期的研究发现，肝纤维化小鼠体内IL-22及其特异性受体 IL-22R1和 IL-10R2明显升高，提示肝星状细胞中IL-10R2和IL-22R1呈高表达。肝组织中除了肝细胞，肝星状细胞也是IL-22的靶细胞。研究表明，IL-22治疗可阻止T细胞性肝炎的发展、刺激肝脏再生[7]，延缓脂肪肝的进展[8-9]，诱导肝星状细胞的衰老，从而改善肝纤维化发生[10]。本研究中模型组小鼠第 8 周可检测到脾脏 Th22细胞比例升高及肝脏组织的IL-22 mRNA 水平升高，提示Th22细胞和IL-22参与了肝纤维化的发病过程，Th22细胞分化可能与肝纤维化发病过程中肝脏的自身免疫反应有关。

miR-200主要参与蛋白磷酸化、DNA结合、RNA代谢调控、小泡碎片过程。有研究发现，miR-200a在肝纤维化、肝硬化及肝癌中的表达下调，且随着肝纤维化进展及其程度加深，miR-200a的表达会更低[11-15]。肝癌患者miR-200a表达降低，且miR-200a低表达者的预后较高表达者好，机理是miR-200a经靶基因MACC1发挥了抑制肿瘤生长和转移的作用[16]。另外有研究发现在大鼠肝纤维化模型中，miR-200a 可以通过Wnt/β-catenin和TGF-β通路降低肝星状细胞活性，从而减缓肝纤维化的发展[17]。miRNAs在不同疾病中对辅助T细胞有一定的调控作用。对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的研究表明，miR-20b的异位表达可抑制Th17细胞在体外的分化，体内过表达miR-20b可导致Th17细胞数量下降，并减轻自身免疫性脑脊髓炎的严重程度[18]。在小鼠肝炎模型中，使用miR-let-7a 预处理后，小鼠肝组织中的Th17细胞显著下降，而调节性T细胞数量明显上升[19]。本研究结果显示，小鼠模型组肝脏组织的miR-200a mRNA的相对表达量明显低于对照组(P<0.05)，提示miR-200a参与了肝纤维化的发生发展，但是肝纤维化免疫微环境中的miR-200a对Th22细胞的调控机制尚未明确，需要进一步研究。

综上所述，肝纤维化小鼠的脾脏Th22细胞亚群比例明显升高，肝纤维化小鼠肝脏组织中IL-22呈高表达，但是肝纤维化小鼠肝脏组织中miR-200a呈低表达，Th22细胞和miR-200a mRNA是否存在交互作用协同参与肝纤维化的进展还有待进一步的研究证实。