曾娜

【摘要】目的：分析益气养阴活血法对自发性2型糖尿病心肌病变（Diabetic cardiomyopathy， DCM）大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法：选择由本院自养新生纯种大鼠60只。随机分为模型组（对照组、观察组）和正常组，使用链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）诱导建立模型，观察组第4周龄使用益气养阴活血复方治疗，对照组无治疗。对比不同大鼠一般情况，心肌细胞凋亡及增殖情况。结果：模型组大鼠均建模成功，血糖均≥16.67 mmol/L，在建模一周后出现多饮、多食、多尿现象，体重减轻，无活动，给药观察组上述情况均有所改善。对照组心肌对位结构，肌原纤维，线粒体均异常改变；观察组心肌肌节、肌源纤维、线粒体基本正常。心脏重量指数、血糖从高到底依次为对照组>观察组>正常组，体重为正常组>观察组>对照组（P<0.05），对照组大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡细胞明显高于正常组和观察组，Bcl-2、Bcl-2/Bax值则低于其他组（P<0.05）；观察组PCNA阳性细胞数明显高于正常组与对照组，凋亡细胞情况高于对照组（P<0.05）。结论：益气养阴活血法可降低自发性2型DCM大鼠心肌细胞凋亡情况，增强其细胞增殖活性，并改善心肌细胞结构。

【关键词】益气养阴活血法；自发性2型DCM大鼠；心肌细胞凋亡；影响

[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）05-0010-02

糖尿病心肌病变（Diabetic cardiomyopathy， DCM）则为糖尿病患者常见的并发症之一[1]。最早在1983年时Tahini等人发现使用链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）诱导糖尿病大鼠后，其心肌功能在第6～14周出现改变，后在梁自文等实验中也在证明糖尿病与心肌病变之间存在直接联系[2-3]。糖尿病可引起心脏微血管病变出现心肌代谢紊乱，最终导致心肌广泛局灶性坏死，在早期常可见患者心肌顺应性下降舒张期充盈受阻为主的舒张功能不全现象。本文使用STZ诱导建立DCM大鼠模型，旨在研究益气养阴活血法对自发性2型DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响，为临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择由本院自养新生纯种大鼠60只。随机将其分为模型组（对照组和观察组）。模型建立：对照组20只，观察组20只，另设置正常组20只。对照组和观察组在出生后24 h内使用腹腔注射由美国Sigma公司所提供的STZ（90 mg/kg），并在第6 d后再次注射STZ（45 mg/ kg）；正常组则注射相同剂量的枸橼酸钠缓冲液。所有大鼠均在注射后6周检测大鼠糖耐量、血清胰岛素情况。大鼠空腹血糖有轻度升高，在糖耐量检测中1 h血糖超过16.65 mmol/L、血清胰岛素表现为相对不足则表示成功建模。观察组大鼠则在大鼠第4周龄使用益气养阴活血复方（组成药物人参、麦冬、五味子、丹参、檀香等药物），用水煎呈1 mL药液含2 g生药的200 %浓度药液，每100 g体重给予0.8 mg，每天进行一次治疗，对照组大鼠则不给予治疗。在饲养到16周龄时处死。

1.2方法 ①大鼠一般情况观察：在实验期间需要观察大鼠饮水、排尿、精神、活动等一般情况，在处死前禁食后12 h称量大鼠体重以及空腹血糖情况。②大鼠心肌细胞情况观察：将大鼠处死，采血后取出心脏，使用冰生理盐水将包膜、血管清洗干净，称重大鼠心脏重量，与大鼠体重的比值为其心脏肿重量指数。随后后取大鼠左心室前壁的心脏组织经处理后使用透射电镜观察。并组化染色检测心肌细胞中死亡因子（FasL）、死亡因子受体（Fas）、Bax蛋白、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA）蛋白表达情况。Fas、FasL、Bax、Bcl-2细胞浆内为棕黄色（或是棕褐色）的片状表达，病理图像分析使用MIPS系统分析。在高倍镜（×400）下测定细胞阳性的平均灰度值；PCNA在細胞核中为棕褐色表达，随机选择5个视野进行计数并选取平均值。

心肌细胞凋亡原位标记检测，在标本制片，使用水和多聚甲醛（4%）进行浸泡，实践为15 min，再使用蛋白酶K进行消化，时间为12 min，随后使用多聚甲醛（5 min）、平衡缓冲液10 min，标记液2 h使用3 %的过氧化氢浸泡4 min，最后链霉亲和素浸泡，时间为20 min。使用显微镜观察，在随机5个高倍镜视野下技术，阳性细胞的百分数并取其平均值。细胞凋亡：DAB着色细胞核表现为棕黄色则代表凋亡细胞。

1.3观察指标 对比不同大鼠的一般情况（心脏重量指数、体重、血糖、心肌超微结构改变情况等）心肌细胞凋亡及增殖情况。

1.4统计学方法 采用SPSS25.0软件包进行处理。计量资料以均数±标准差（_ x±s）表示，多组间比较使用方差检验，事后两两比较采用SNK-q；计数资料采用率或百分百进行描述，进行c2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1三组大鼠一般情况比较 正常组大鼠一般情况正常；模型组大鼠均建模成功，侧血糖均≥16.67 mmol/L，均存活至16周，在建模一周后大鼠出现多饮、多食、多尿现象，体重减轻，活动能力下降，皮肤有破损或出血现象，给药观察组则上述情况均有所改善。

心肌超微结构观察发现，正常组大鼠心肌情况基本正常；模型组：①对照组大鼠心肌结构改变，对位错乱，出现有过度收缩，肌原纤维部分溶解，线粒体可见肿胀明显，可嵴断裂溶解和小空泡；②观察组大鼠心肌肌节对有少部分出现错位，其他情况基本正常。

心脏重量指数、血糖从高到底依次为对照组>观察组>正常组，体重从高到底依次为正常组>观察组>对照组，三组之间比较差异存在统计学意义（P<0.05），详见表1。

2.2模型组大鼠心肌细胞凋亡与增殖情况比较 对照组大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡细胞明显高于正常组和观察组，Bcl-2、Bcl-2/Bax值则低于正常组和观察组（P<0.05）；观察组PCNA阳性细胞数明显高于正常组与对照组，凋亡细胞情况明显低于对照组（P<0.05），详见表2。

3 讨论

DCM发病机制较为复杂，中医治疗药物以整体性、辩证论治为特色，对于糖尿病以及其并发症防治中有着较为明显的优势。DCM在中医中属于“心悸”、“消竭”、“胸痹”、“心痛”、“胸痛”等范畴，血瘀、气虚为其主要病机。以往有文献研究证明使用益气养阴活血法对于DCM治疗有较好的临床使用效果，可通过多通路、多靶点减轻心肌纤维化情况，从而达到延缓高血糖大鼠出现DCM[4]。在本文研究中使用益气养阴活血法方剂中包括人参、麦冬、五味子、丹参、檀香等药物中，人参药理研究中发现，其可调节血脂、控制血压、减轻患者体重改善患者凝血功能从而达到调整糖尿病患者机体代谢紊乱装状况。药单体有抑制TGF-β1分泌，减少心肌细胞凋亡延缓心肌细胞纤维化作用。麦冬中皂苷、多糖、黄酮等有效成分，可起到降血糖、抗氧化等作用从而产生对心肌的保护。五味子药理学研究证明可降血糖、血压同时增强机体免疫力。丹参则有活血调经、祛瘀止痛、养血安神等过作用，檀香具有消肿、止血、定痛的作用研究表明，檀香与丹参相配可增加丹参的吸收入血，使其作用持久。

在本文研究中发现在16周后DCM大鼠模有典型的糖尿病心肌病变，大鼠心肌细胞凋亡情况也明显高于其他两组，与以往文献研究结果相符[5]。而在使用益气养阴活血复方治疗的观察组大鼠中，心肌肌节对位基本正常，有少部分出现错位，肌源纤维、线粒体基本正常。心脏重量指数、血糖从低于对照组，体重从高于对照组（P<0.05），与以往文献研究结果相符[6]，提示使用益气养阴活血复方可改善CDM大鼠体重、血糖、心肌细胞情况。以往文献研究中均表明，Fas、FasL和 Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax比值是细胞凋亡的重要影响因素[7]。在本研究结果中发现，使用益气养阴活血复方治疗后，降低了心肌细胞中促凋亡因子Fas、FasL和 Bax表达，Bcl-2/Bax比值则增加，且凋亡细胞明显减少，提示益气养阴活血复方可减少氧自由基生成，保护了抗氧自由基酶系统活性，起到调控凋亡因子的变化减少心肌细胞凋亡。PCNA直接参与了DNA复制，是细胞增殖活性的重要指标。在本研究中对照组与正常组PCNA阳性数比较并无明显差异可能与本研究大鼠未出现心肌细胞异常增殖有关。而观察组大鼠心肌PCNA阳性比例明显高于其他两组提示此药方可有启动心肌细胞的增殖作用，达到防治DCM的目的。

综上所述，益气养阴活血法可降低自发性2型DCM大鼠心肌细胞凋亡情况，增强其细胞增殖活性，并改善心肌细胞结构。

参考文献

[1] 李中南， 周媛媛， 邢宇婷， 等. 益气养阴活血法对糖尿病大鼠肾脏Nrf2基因表达的影响[J]. 湖北中医药大学学报， 2018， 20（6）： P. 13-16.

[2] 張小红， 钟淙， 王芳， 等. α-硫辛酸联合益气养阴活血法对2型糖尿病周围神经病变患者相关因子的影响[J]. 海南医学院学报， 2018， 24（21）： 36-40.

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[4] 柴松波， 王振涛， 张淑娟， 等. 丹参酮ⅡA对扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡及PI3K/Akt通路的影响[J]. 中国比较医学杂志， 2019， 29（6）： 57-64.

[5] 秦琦， 李文杰， 王有雪， 等. 益气养阴通络法对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡Bax、Bcl-2、Caspase3表达的影响[J]. 中华中医药学刊， 2019， 37（6）： 1392-1395.

[6] 秦琦， 李文杰， 杨莺， 等. 中药对大鼠心肌细胞凋亡影响的Meta分析[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2018， 16（19）： 2766-2773.

[7] 刘颖， 张军， 王顺意， 等. 益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠骨骼肌miR-24表达的影响[J]. 环球中医药， 2018， 11（10）： 30-34.