李彦忠，喻军强，李明

（兰州大学草地农业教育部工程研究中心，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学甘肃省西部草业技术创新中心，兰州大学草业科学国家级实验教学示范中心，兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa，简称为苜蓿）是全世界重要的豆科类牧草，在农牧业生产中发挥着极其重要的作用［1］。据统计，苜蓿在全世界的种植面积约3220万hm2，和小麦（Triticum aestivum）在美国并列成为第三大重要作物；我国紫花苜蓿种植面积约377万hm2，居各类栽培牧草之首，主要分布于西北、华北和东北地区［2－5］。因其蛋白质含量高、氨基酸含量丰富、产量高、适口性好，故有“牧草之王”的美誉［6］。苜蓿栽培草地的种植规模和生产水平是衡量一个国家畜牧业现代化程度的重要标志［7］。但是目前我国苜蓿产业发展存在诸多问题，最主要的问题是产不足需、质量水平不高［8－9］。随着我国畜牧业的快速发展，其对苜蓿的需求量越来越多，而现阶段无论在数量上还是在质量上，我国生产的苜蓿均无法满足畜牧业生产的需要［10－11］。2016年我国进口苜蓿近150万t，进口量约为2008年的80倍。据估计近年我国苜蓿约50%的需求总量仍需依赖进口［11］。

苜蓿病害会降低草产品的质量和生产性能，并且会危害家畜健康，我国在紫花苜蓿上已发现36种真菌病害［12］。苜蓿褐斑病（Pseudopeziza medicaginis）是一种常见的苜蓿病害，随着病害程度的加深，病叶与健叶相比，光合速率和粗蛋白含量均显著下降，叶片中总酚、单宁、钙、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分均显著增加［13－14］。由夏季霜霉菌（Peronospora aestivalis）引致的苜蓿霜霉病是一种世界性病害，严重影响世界各国的苜蓿产业发展［15］。在我国，已知该病分布于14个省，不同海拔地区均有分布，均可造成危害［15］。其可使苜蓿的草产量、品质、种子产量和根瘤大幅度下降［16］；能明显影响苜蓿的生理和生物学性状，感染植株与健康植株相比，株高、分枝数、花序数、水分含量和叶绿素含量均出现不同程度的下降［17］；能使苜蓿叶片光合作用降低，有机物贮量和根系养分积累减少，植株越冬不良，草地提早衰败退化，已成为我国苜蓿生产的主要限制性病害之一［18］。据统计，全世界每年由根腐病造成的苜蓿产量损失在20%左右，严重时高达40%［19－20］。苜蓿根腐病普遍发生在我国西北（甘肃、新疆、青海等）、华北（河北和内蒙古等）和东北地区（黑龙江和吉林等）等苜蓿主要种植区，其能降低植株根系吸收水分的能力，影响幼苗的正常生长，从而导致植株生物量下降，甚至使植株死亡［21－23］。

防治苜蓿病害的措施有很多，抗病品种的利用是防治苜蓿及其他牧草病害的最有效和最主要的措施之一［15，24－27］。因此，本研究于2015年对在兰州大学榆中校区试验地种植的48个苜蓿品种进行了田间病害调查，调查发现试验地内的主要病害是褐斑病、霜霉病和根腐病。安欢乐［28］经分离培养、形态学鉴定、分子鉴定、致病性测定和再分离，最终确定根腐病的主要病原为锐顶镰刀菌（Fusarium acuminatum）。并对48个品种进行了综合评价，以期筛选出优良、优质和抗病性强的苜蓿品种，为选择适合当地种植的苜蓿品种和抗病育种材料的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于兰州大学榆中校区，属温带大陆性气候，海拔1680 m（35.87° N，104.09° E），年均降水量为381.8 mm，蒸发量为1450 mm，无霜期120 d左右，相对湿度63%，全年日照时数2607.2 h，年平均气温为6.7℃，1月平均气温－8℃，7月平均气温19.0℃，试验地平坦，在苜蓿生长期灌溉2～3次，采用大水漫灌。于2013年6月进行播种。

1.2 供试苜蓿品种

总计48个供试苜蓿品种（表1）。

表1 供试苜蓿品种及其来源Table 1 Alfalfa varieties and their resources in the experiment

1.3 田间试验设计

采用随机区组试验设计，每个品种3个重复，小区面积5.0 m×2.4 m，小区间距0.6 m，穴播，每个小区共计24株苜蓿，株距和行距均为0.6 m，在苜蓿生长期灌水3次，未施肥。

1.4 病害调查与抗病性评价

1.4.1 病情分级标准 各地上病害的分级标准根据田间发病情况并参照北美苜蓿会议（North American Alfalfa Improvement Conference，NAAIC）的标准略有改动后制定分级标准［29］，共分为5个病级，其中0级，植株茎叶无病斑，叶片呈正常的绿色；1级，病斑占叶片面积的25%以下；2级，病斑占叶片面积的26%～50%，并且叶片开始褪绿；3级，病斑占叶片面积的51%～75%，病斑坏死且叶片发黄；4级，病斑占叶片面积的75%以上，叶片发黄并脱落。

1.4.2 病害调查 于2015年5－7月对病害进行了调查，用一般调查和重点调查相结合的方法。一般调查主要了解苜蓿病害的分布以及发病程度，进行分析归类。一般调查后将发生严重的病害进行重点调查，深入了解其分布、发病率、发生规律等［30］。统计每小区内（全部植株）发病植株数和各病级植株数，计算发病率和病情指数。

1.4.3 抗病性评价标准 参照美国苜蓿和牧草联盟（National Alfalfa & Forage Alliance，NAFA，2019）的标准，根据健康植株的百分比确定每个品种的抗病级别（表2）。

表2 抗病性评价标准Table 2 Evaluation criteria of resistance ratings

1.5 测定指标

统计每小区内所有植株的株高（地面至最高处垂直距离）和分枝数。

1.6 综合评价

采用隶属值函数标准差系数赋予权重法进行综合评价，具体步骤如下［31］：采用公式（1）计算各个指标的隶属函数值。

式中：μ（Xj）代表第j个指标的隶属函数值；Xj表示第j个指标值；Xmin表示第j个指标的最小值；Xmax则表示第j个指标的最大值。如果指标与抗病性呈正相关时用公式（1）计算该指标的隶属函数值，若指标与抗病性呈负相关时用公式（2）进行反隶属函数进行转换，计算该指标的隶属函数值。

采用公式（3）计算标准差系数（Vj），归一化后得到各个指标的权重系数（Wj），见公式（4）。

采用公式（5）计算各品种的综合评价值。

式中：D为用若干指标综合评价所得的综合评价值。根据D值的大小对供试材料抗病性的强弱进行排序，D值越大抗病性越强，反之则越弱。

1.7 统计分析

采用Excel 2010、SPSS 25.0进行数据的处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 48个苜蓿品种累计死亡率比较

48个品种的累计死亡率介于0～93.07%，累计死亡率最高的是UC-1465，为93.07%；累计死亡率介于26%～74%的品种有8个，分别是Avrora、甘农5号、Hunter Field、Hunter River、Saranac AR、Siriver、Trifecta、UC-1887；累计死亡率介于1%～3%的品种有11个，分别是Derby、Vertus、甘农4号、宁苜1号、蔚县、图牧1号、图牧2号、草原2号、Sanditi、中兰1号、中苜1号；其余28个品种的死亡率均为0；品种间差异显著（P＜0.05）（表3）。

表3 48个苜蓿品种的累计死亡率Table 3 Cumulative mortality rate of 48 alfalfa varieties

2.2 48个苜蓿品种株高和分枝数比较

不同品种间的同一指标各有差异。从株高来看，48份苜蓿材料的株高在0～67.50 cm（表4），株高最高的品种是中兰1号；株高为0 cm的品种有15个，分别是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘农1号、甘农3号、甘农6号、中牧1号；株高介于50～64 cm的品种有9个，分别是新牧1号、Vertus、陇东苜蓿、天水、新疆大叶、中苜1号、中苜3号、公农2号、蔚县；株高介于1～16 cm的品种有3个，分别是Trifecta、Arc、Sanditi；其余20个品种的株高介于17～49 cm；品种间差异显著（P＜0.05）。

表4 48个苜蓿品种株高和分枝数比较Table 4 Comparison of plant height and branch number of 48 alfalfa varieties

从分枝数来看，48份苜蓿材料的分枝数在0～56枝（表4），分枝数最多的品种是Vertus，为56枝；分枝数为0的 品 种 有15个，分 别 是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘农1号、甘农3号、甘农6号、中牧1号；分枝数介于30～56枝的品种有11个，分别是Vertus、中苜1号、公农1号、公农2号、中兰1号、蔚县、中苜3号、新疆大叶、陇东苜蓿、天水和新牧1号；分枝数介于1～10枝的品种有7个，分别是Arc、Sanditi、Trifecta、Vernal、甘农4号、Jindera和甘农7号；其余15个品种的分枝数介于11～29枝；品种间差异显著（P＜0.05）。

2.3 不同苜蓿品种间抗褐斑病的比较

48个苜蓿品种褐斑病的发病率在33.33%～100.00%（表5），且不同品种褐斑病的发病率存在显著差异（P＜0.05）。其中发病率最低的是UC-1465，发病率仅为33.33%；发病率达到100%的有20个品种，分别是Vertus、WL168HQ、WL354HQ、WL343HQ、公农2号、甘农1号、甘农3号、甘农5号、甘农6号、甘农7号、中兰1号、宁苜1号、新疆大叶、Jindera、天水、蔚县、中苜3号、无棣、陇中、图牧1号；其余27个品种的发病率介于34%～99%。

48个苜蓿品种褐斑病的病情指数范围为17.78～52.22（表5），其中UC-1887、Vernal的病情指数均最低，仅为17.78，并与甘农1号、新牧2号存在显著差异（P＜0.05）；病情指数高于52的材料有2份，分别为甘农1号、新牧2号，其余44个品种的病情指数介于18～52。

参照NAFA标准，48个苜蓿品种对褐斑病的抗性是UC-1465为高抗（HR）品种，UC-1887为抗病（R）品种，Siriver和Trifecta为中抗（MR）品种，Avrora、Hunter River、Saranac AR为低抗（LR）品种，其余41个品种均为感病（S）品种（表5）。

表5 48个苜蓿品种的褐斑病发病情况及其抗病级别Table 5 Incidence of common leaf spot and resistance level of 48 alfalfa varieties

2.4 不同苜蓿品种间抗霜霉病的比较

48个苜蓿品种霜霉病的发病率在0～27.77%（表6），其中Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘农1号、甘农3号、甘农6号、中牧1号的发病率为0；新疆大叶和天水的发病率均最高，为27.77%；其余32个品种的发病率介于1.37%～25.63%。

48个苜蓿品种霜霉病的病情指数范围为0～81.67（表6），其中Avrora、Hunter Field、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘农1号、甘农3号、甘农5号、甘农6号、中牧1号的病情指数为0，并与品种蔚县、中苜1号等存在显著差异（P＜0.05）；病情指数高于78的材料有4份，分别为新疆大叶、蔚县、中苜1号、新牧1号；其余27个品种的病情指数介于1～78。

参照NAFA标准，48个苜蓿品种均高抗苜蓿霜霉病（表6）。

表6 48个苜蓿品种的霜霉病发病情况及其抗性级别Table 6 Incidence of downy mildew and resistance level of 48 alfalfa varieties

续表Continued Table

2.5 不同苜蓿品种间抗锐顶镰刀菌根腐病的比较

48个苜蓿品种锐顶镰刀菌的发病率在0～33.33%（表7），其中发病率最低的是Saranac、Siriver、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘农3号、中兰1号、Jindera、天水、中苜3号、无棣、陇中、甘农2号，发病率为0；发病率最高的是UC-1465，为33.33%；其余33个品种的发病率均介于1.40%～27.77%。

参照NAFA标准，48个苜蓿品种均高抗苜蓿锐顶镰刀菌根腐病（表7）。

表7 48个苜蓿品种锐顶镰刀菌根腐病发病情况及其抗性级别Table 7 The incidence and resistance level of F.acuminatum root rot in 48 alfalfa varieties

2.6 紫花苜蓿种质资源综合评价

采用隶属值函数结合各个指标的权重系数，对48个苜蓿品种进行综合评价［31］。D值越大，表明该品种抗病性越强，反之越弱。根据D值的大小进行排序，排在前面3个的苜蓿品种为Vertus、中兰1号和新牧1号；评分最低的3个品种为UC-1887、UC-1465和Saranac AR（表8）。

表8 48个苜蓿品种的综合评价得分及其排序Table 8 Comprehensive evaluation scores and ranking of 48 alfalfa varieties

续表Continued Table

3 讨论

研究表明，锐顶镰刀菌可以侵染植物的根茎部和根部，同时也可作为初侵染和次侵染而引起植物根腐病的发生［32－34］。本研究发现在兰州大学榆中校区品种比较试验田中，苜蓿矮小、萎蔫、死亡植株较多，且在死亡苜蓿植株上分离到了锐顶镰刀菌等病原真菌，安欢乐［28］经过致病性测定和再分离发现，锐顶镰刀菌致病性最强，再分离率也较高，可导致植株根部和根茎部出现明显的变色，这是本研究中死亡植株较多的主要原因。

李春杰等［15］、金娟等［35］、陈申宽等［36］、辛宝宝等［37］分别对苜蓿品种在不同地区主要病害进行抗性评价和鉴定，本试验得到的结果与这些学者有所不同，可能是由于评价方法不同引起的，本试验是以健康植株比例为主要指标进行评价的，而李春杰等［15］、陈申宽等［36］、辛宝宝等［37］是以发病率和病情指数为指标进行评价的，金娟等［35］是以相对抗性指数为指标进行评价的。因此应该建立统一的抗病评价体系和指标，这样能够更有效地筛选适合我国不同地区种植的苜蓿抗病品种，以便加速中国苜蓿产业的发展。

在进行不同苜蓿品种抗真菌病害的评价时，参考指标主要有发病率、病情指数、形态学指标和生理学指标等，所有的这些指标都从不同的层面反映出植物对于病害的响应，即使忽略各指标间的差异，仅采用单一指标进行评价，不能充分体现苜蓿材料的综合表现［38］。因此需要构建综合评价模型，将以上指标进行整合，通过科学的计算和分析，客观地将所有品种按照抗病性进行分类，以便应用于生产实践中［39］。目前，应用综合评价模型对品种的综合性能进行评价的研究较少，本试验应用的隶属函数分析法，克服了用单一指标来评价苜蓿抗病性存在片面性和不稳定性的弊端，评价结果更可靠。

4 结论

本研究在甘肃省榆中县对48个苜蓿品种进行了抗褐斑病、霜霉病及锐顶镰刀菌根腐病的评价，结果表明：供试的48个苜蓿品种均高抗霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病，对褐斑病的抗性品种为高抗品种1个（UC-1465），抗病品种1个（UC-1887），中抗品种2个，低抗品种3个，其余41个品种均为感病品种。

对48个苜蓿品种进行隶属函数分析，结果表明：Vertus、中兰1号和新牧1号对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病均具有较强的抗病性，为高抗品种；UC-1887、UC-1465和Saranac AR对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病的抗病性均较差，为感病品种。若以上3种病害在该地区造成重大损失时，应首选上述高抗品种在该地区进行栽培种植。