韩金怡，苏志勇

(1.锦州医科大学赤峰学院培养基地，内蒙古 赤峰 024000；2.赤峰学院附属医院乳腺外科，内蒙古 赤峰 024000；3.赤峰学院附属医院胸外科，内蒙古 赤峰 024000)

近年来临床采用以手术为中心，以放化疗、内分泌治疗为辅助的综合治疗模式显著降低了乳腺癌复发和病死率，但有一部分患者化疗获益甚少，在予以相同临床干预情况下，后期疾病转归大不相同，医生对化疗获益程度及复发风险等级的判断缺乏客观指标支持，因此乳腺癌尤其是早期乳腺癌患者术后管理及治疗决策一直是临床争议的焦点，准确对其复发风险进行评估有重要意义[1-2]。基于此背景，乳腺癌21基因检测应运而生。相关研究[3-4]发现，21个肿瘤相关基因的表达量和乳腺癌复发风险相关，该21个基因由6组基因组合而成。Luminal A型是乳腺癌患者常见的分子分型，研究[5]发现有脉管转移、肿瘤直径>2 cm、有淋巴结转移是Luminal A型乳腺癌患者术后复发转移的危险因素，但利用21基因检测评估乳腺癌患者复发风险影响因素的研究甚少。本研究主要分析乳腺癌21基因检测对早期Luminal A型乳腺癌治疗的指导作用及其相关因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年12月内蒙古赤峰学院第一附属医院接受相关诊治的雌激素受体(ER)和(或)孕激素受体(PR)阳性、人表皮生长因子受体-2(HER-2)阴性、经病理认定腋窝淋巴结转移阴性的早期Luminal A型乳腺癌患者174例，均为女性，年龄18～70岁，平均(44.19±4.57)岁。病例纳入标准：①术后经组织病理学确诊为非特殊型浸润性乳腺癌[6]；②ER/PR(+)，HER-2(-)或HER-2(+)或HER-2()，如果为HER-2()，则需经荧光原位杂交技术检测且结果为阴性；③腋窝淋巴结转移经病理检测为阴性；④血常规、肝肾功能无明显异常；⑤患者及家属同意行21基因检测并得出复发风险分数(RS)。排除标准：①全身检查如磁共振、超声、CT及PET/CT等发现有其他脏器转移者；②对内分泌治疗有禁忌证或在化疗前经相关检查有化疗禁忌证者；③处于育龄期患者，经血清妊娠试验结果为阳性，或正在哺乳期者；④有严重内脏器质性病变或体力状况评分在1分以上、临床资料不完整者。本研究经医院相关伦理委员会书面同意，且患者或家属均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组织化学染色：采用组织芯片制作机细针打孔方法从患者组织蜡块(称为供体蜡块)中采集数十至上百圆柱形小组织(组织芯)，并将组织芯整齐排列到另一空白蜡块(受体蜡块)中，随即制成组织芯片蜡块。对组织芯片蜡块进行切片后转移到载玻片上制成组织芯片。将采集到的组织芯片制成4 μm连续切片，以二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，切片后经柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)微波抗原修复，以3% H2O2及非免疫血清分别灭活内源性过氧化物酶活性与非特异性结合位点，再与一抗ER、PR、HER-2及Ki67于4 ℃条件下孵育过夜。第2天切片经PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗，DAB显色，苏木素复染。PBS代替一抗做阴性对照，以排除二抗非特异性结合。

1.2.2 21基因检测：采用罗氏Roche 480荧光定量PCR(RT-PCR)仪进行21基因检测。由广州阅微医学检验所(以下简称检验所)与赤峰学院附属医院签订外送协议，检验所将21基因检测结果与美国Oncotype Dx®试验数据进行对比，结果应完全一致，以液相芯片技术替代传统RT-PCR扩增技术检测所有患者乳腺癌组织石蜡切片21基因在肿瘤组织中的表达情况。将检测结果量化为RS。RS=20×(RSu-6.7)，其中Rsu为未校正的RS评分。RS范围0～100分，数值越大，复发风险越高，越能从化疗中获益。RS<18分确定为低度复发风险，18分≤RS<31分确定为中度复发风险，RS≥31分确定为高度复发风险[7]。在本研究中，预先设定RS<18分为低风险组，RS≥18分为中高风险组。

1.2.3 治疗方案选择与评估：对患者进行术前病情评估，术后标本经组织芯片制备及免疫组织化学染色得出患者免疫组化结果及TNM分期，依据美国国立综合癌症网络(NCCN)指南[8]分为低复发风险组及高复发风险组，均由内蒙古赤峰学院第一附属医院乳腺外科科室根据指南讨论后制定治疗方案，对低复发风险组[进行单纯内分泌治疗(H方案)]和高复发风险组[进行化疗序贯内分泌治疗(CH方案)]。两组患者均在其同意下进行21基因检测并得出RS，再根据RS制定方案，当RS<18分时(低风险组)可单纯进行H方案治疗，当RS≥18分时(中/高风险组)可进行CH方案治疗。利用传统TNM分期结合NCCN指南制定两组患者的不同治疗方法，分别与21基因检测所得出的RS及不同分组治疗意见进行对比，总结两组患者经不同检测方法制定的治疗方法间的差异，进而得出目前应用21基因检测所带来相应治疗方案选择上的精准度。

1.2.4 患者随访：对所有患者随访至2019年12月，中位随访时间36个月。随访方式为患者出院后定期复查结果、电话随访，21基因检测前及检测后所有患者均未出现局部或远位脏器转移情况。

1.2.5 资料收集：收集所有患者临床资料，包括年龄、绝经状态、肿瘤直径、病理组织学分级、脉管癌栓、Ki67等，分析其与RS的相关性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件处理数据，计数资料以[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验或配对卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者组织染色结果 见图1。早期Luminal A型乳腺癌患者中ER、PR均为阳性表达。部分患者HER-2呈阳性表达或阴性表达，Ki67呈高表达或低表达。根据NCCN指南，只要ER、PR为阳性，即进行内分泌治疗，且随ER、PR阳性率增高，其内分泌治疗效果越明显。

A：ER(+)；B：ER(-)；C：PR(+)；D：PR(-)；E：HER-2()；F：HER-2(-)；G：Ki67高表达；H：Ki67低表达

2.2 21基因检测及RS评估前后治疗决策对比 见表1。21基因检测及RS评估前，初步确定66例(37.9%)适用于H方案，均为低复发风险者；108例(62.1%)患者适用于CH方案，其中低风险者66例(37.9%)，中高风险者42例(24.2%)。经21基因检测进行复发风险评估后决策发生变化，共132例(75.9%)建议进行H方案治疗，其中66例(37.9%)从建议进行CH方案治疗改为H方案治疗，低风险者48例(27.6%)，中高风险者18例(10.3%)；建议进行CH方案者42例(24.2%)，其中低复发风险者6例(3.5%)，中高复发风险者36例(20.7%)，无增加辅助化疗者。经统计学分析，21基因检测及RS评估前后治疗方案比较有统计学差异(P<0.01)。

表1 21基因检测及RS评估前后治疗决策对比[例(% )]

2.3 临床特征与RS相关性分析 见表2。复发风险与年龄、绝经状态、肿瘤直径、病理组织学分级等无明显相关性(均P>0.05)，而与Ki67表达及脉管癌栓相关(均P<0.01)。

表2 临床特征与RS相关性分析[例(% )]

3 讨 论

多数恶性肿瘤早期均无明显症状、体征，乳腺癌患者在这方面尤其显得突出。但随着人们健康意识增强，很多乳腺癌患者通过体检发现乳腺肿块并通过其他手段得以确诊，因此早期乳腺癌患者增加。随着诊疗技术逐渐完善，早期乳腺癌患者经系统规范的综合治疗后，大多数取得较好预后[9]。乳腺癌为高度异质性疾病，其分子分型又称为Luminal分型，是临床上根据乳腺癌的免疫组化染色结果表现进行划分的，至少分为十几个亚型，因技术条件所限，临床上无法精准分型，常分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性及三阴性乳腺癌[10-11]，其中Luminal A型为较常见分子亚型，复发率低，对内分泌治疗敏感，对化疗不敏感。乳腺癌21基因检测的21个基因由6组基因组合而成，其中5组肿瘤相关基因包括增殖相关基因(Ki67、STK15、Survivin、Cyclin B1、Mybl2)、侵袭相关基因(Stromely sin3、Cathepsin L2)、HER-2相关基因(GRB7、HER-2)、激素相关基因(ER、PR、Bcl-2、Scube2)、其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)以及内参基因(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)[12-13]，然而目前关于21基因检测在Luminal A型患者治疗中的指导意义研究甚少。

杨玉庆等[14]发现，在乳腺癌患者中，与低危组比较，中高危组接受化疗的患者更多；相较于21基因检测之前，低危浸润性癌有较明显的治疗决策改变。本研究中，21基因检测及RS评估前初步确定66例适用于采用H方案，均为低复发风险者分别，占37.9%，而108例患者适用于CH方案，其中低风险、中高复发风险者分别占37.9%和24.2%；经21基因检测进行复发风险评估后决策发生变化，共计132例建议进行H方案治疗，其中66例(37.9%)从建议进行CH方案治疗改为H方案治疗，低风险者48例(27.6%)，中高风险者18例(10.3%)；建议进行CH方案治疗者42例(24.2%)，其中低复发风险者6例，中高复发风险者36例，无增加辅助化疗者。经统计学分析，21基因检测及RS评估前后治疗方法比较有统计学差异，表明21基因检测对指导Luminal A型乳腺癌患者的治疗有积极意义。

通过21基因检测获得的RS针对早期Luminal A型乳腺癌患者比传统临床病理指标更能准确预测临床结果并用于临床实践。RS可作为预测早期Luminal A型乳腺癌患者远期是否有复发风险的量化指标。高RS早期Luminal A型乳腺癌患者从CH方案治疗中会有较大获益；对于低RS早期Luminal A型乳腺癌患者来说，无需辅助化疗，进行H方案治疗即可；对中RS早期Luminal A型乳腺癌患者来说，CH方案治疗能否降低疾病复发风险目前没有明确结论，还需要后续进一步研究。本研究证明，使用21基因检测及RS分级来判断患者复发风险的高低对早期Luminal A型乳腺癌患者治疗方案选择具有重要临床指导意义[15]。Wang等[16]也发现，在所有乳腺癌患者中，高RS被认为是推荐化疗最重要的影响因素。对具有高RS的Luminal A样亚型患者或具有低RS的Luminal B型患者，已证明21基因的RS为推荐化疗最重要的独立因素。因此，21基因RS是影响化学疗法决策的重要因素，值得进一步临床评估。

洪进等[17]发现，淋巴结转移、年龄、月经状态为影响Luminal A型早期乳腺癌化疗决策的重要因素，70岁以上患者或淋巴结阴性的绝经后患者倾向于不接受化疗。Wu等[18]认为，组织分级、PR状态、Ki67均为RS的独立影响因素。瞿飞麟等[19]发现，在激素受体阳性早期乳腺癌患者中，孕激素受体(PGR)、Ki67及组织学分级为影响RS的独立影响因素。由于缺乏统一的标本制作程序以及Ki67表达阳性率检测方法及其临床界值界定，目前区分Ki67高低表达的临界值从3.5%～34%均有报道。本研究考虑到不同实验室Ki67表达阳性率检测方法不同可能造成结果很大程度上的差异，及对化疗可能受益的Luminal A型乳腺癌治疗不足的可能，因此选择较低界值(14%)进行界定，发现其对21基因RS有一定影响。本研究也发现21基因检测及复发风险分组与早期Luminal A型乳腺癌患者年龄、组织病理学分级(1～2级)、女性月经状态、肿瘤直径等无相关性，而与Ki67及有无脉管癌栓呈正相关。对于早期Luminal A型乳腺癌患者来说，这些既往被归为增加复发危险分级的因素可通过21基因检测给予RS所替代，RS分析的作用显著优于年龄和肿瘤大小作为独立预后因素的作用[20-21]。

综上所述，21基因检测对早期Luminal A型乳腺癌患者的治疗决策具有一定指导意义，RS仅与Ki67表达、脉管癌栓有相关性，因此可通过21基因检测给予RS替代年龄、肿瘤直径等作为独立预后因素。但本研究也有一定不足之处：对于早期Luminal A型乳腺癌患者无病生存和总生存数据仍在进一步收集中，目前还无法得出结论；此外，由于研究周期及经济成本等原因，本研究患者入组例数较少，暂无法从经济学角度对21基因检测进行成本效益分析。上述不足将在后续工作中加以完善，以提高21基因检测及RS在早期Luminal A型乳腺癌患者临床实践中的地位。