周文铭，李俐颖，孙欣宇，刘 玥，李 莹，刘冰南

( 大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034 )

我国的水产养殖大致可分为粗养、精细养殖、高密度精细养殖[1]。自20世纪70年代开始，水产养殖产品的种类和产量不断地增加[2]。仿刺参(Apostichopusjaponicus)作为重要的水产养殖品种，因丰富的营养价值而备受人们青睐。由于仿刺参属于底栖生物，过大的养殖密度导致残饵和仿刺参粪便堆积池底，经微生物厌氧发酵产生许多有害物质，从而影响仿刺参生长[3]。除此之外，集约化水产养殖的水环境中会残留大量有机污染物，其在代谢分解过程中产生氮、磷等营养物质并积累，导致养殖水体富营养化水平升高[4]。

微生态制剂是缓解水产养殖水体污染等问题的一种绿色产品，可以调整水体菌群结构，维持水环境稳态，提升水产品产量和综合质量[5-6]。当前，通过施用微生态制剂对养殖水体和水产动物消化道内的微生物群体进行干预，进而增进水产养殖动物健康，这已成为水产动物健康养殖中广泛采用的重要举措。与此同时，各类高效微生态制剂也不断地被开发使用[7]。芽孢杆菌(Bacillus)和光合细菌是两种净水能力较强的微生物。芽孢杆菌具备顽强的生命力，有耐高温、耐强碱等特点，并且能降解大分子有机物[8]。光合细菌是一类具有光能合成体系的微生物，能利用硫化物和氨等，在养殖水体的净化中具有重要作用。

化学需氧量和氨氮含量是衡量水中污染物水平的重要指标，它们可在一定程度上反映水体受污染的程度[9]。另外，水体中微生物在厌氧环境下分解水中硫酸盐，产生硫化氢释放到水环境中，不仅对仿刺参有毒害作用，还会消耗池水中大量的溶解氧[10]。Xia等[11]在养虾水体中投放了芽孢杆菌和光合细菌等益生菌后，检测水质发现，芽孢杆菌、乳酸菌、光合细菌的数量比最初投放时有明显增加，而致病菌减少约80%。投放微生态制剂后，水体中的氨氮质量浓度也有很大程度的降低，水产品产量大幅度提高[12]。陆家昌等[13]研究发现，光合细菌对亚硝态氮的产生有一定抑制作用，且可以降低水体中氨氮和化学需氧量的质量浓度。

虽然水产用微生态制剂产品越来越丰富，但现有的微生态制剂存在孢子成形率低、生长发育迟缓、菌体自溶等问题[14]。目前，市面上缺乏有针对性的微生物净水剂产品，对复合微生物净水剂的特性和效果也缺乏针对性的评估。因此，笔者针对水产养殖过程中的水体净化问题，以水体化学需氧量、氨氮和硫化物含量为衡量指标，开发微生物净水剂产品，并对其在仿刺参养殖过程中的水体净化效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 菌株

本试验使用的芽孢杆菌BS1和光合细菌PSB1(Rhodopseudomonaspalustris)均分离自瓦房店仿刺参养殖池塘。这2株菌在前期试验中发现具有较强净水能力[15]，且属于农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》中的微生物添加剂，能够应用于水产养殖。

1.2 培养基

LB肉汤培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，海水1 L，摇匀充分溶解后，将pH调整至6.8～7.0。

1.3 饲料成分

饲料购自大连博仕奥生物科技有限公司，饲料(含有鼠尾藻、粗蛋白、粗脂肪、矿物质、微量元素、水分、灰分等)与海泥的最终质量比为1∶1。

1.4 配制试剂

(1)人工硫化物污水：葡萄糖5 g，磷酸氢二钾0.75 g，磷酸二氢钾0.25 g，硫酸亚铁0.1 g，硫酸镁0.25 g，硫酸锰0.01 g，硫化钠1.5 mg，海水1 L，摇匀充分溶解。

(2)人工氨氮污水：葡萄糖5 g，磷酸氢二钾0.75 g，磷酸二氢钾0.25 g，硫酸亚铁0.1 g，硫酸镁0.25 g，硫酸锰0.01 g，氯化铵13.37 mg，海水1 L，摇匀充分溶解。

(3)人工化学需氧量污水：葡萄糖5 g，磷酸氢二钾0.75 g，磷酸二氢钾0.25 g，硫酸亚铁0.1 g，硫酸镁0.25 g，硫酸锰0.01 g，邻苯二甲酸氢钾2.13 mg，海水1 L，摇匀充分溶解。

1.5 试验方法

1.5.1 菌液配比优化

将光合细菌PSB1和芽孢杆菌BS1的菌液分别按密度比1∶1、1∶2、2∶1的比例配制为混合菌液，将3种配比的混合菌液分别接种到配制完毕且经过灭菌处理的上述3种模拟人工污水水样中，测定菌液对人工污水中化学需氧量、氨氮、硫化物成分的降解能力。采用国家标准GB 17378.4—2007《海洋监测规范第4部分：海水分析》[16]对人工污水样本中化学需氧量(碱性高锰酸钾法)、氨氮(靛酚蓝分光光度法)、硫化物(亚甲基蓝分光光度法)3个指标进行测定。污水水样每隔2 d测量1次，测量周期为13 d。其中配制试验用人工化学需氧量污水总体积3 L，每次检测取样量100 mL；人工氨氮污水总体积1 L，每次取样量35 mL；人工硫化物污水总体积6 L，每次取样量为200 mL。每个指标检测设3个平行样本，测定步骤严格按照国家标准GB 17378.4—2007规定进行操作，记录数据。经过比对分析，从中确定净水效果最佳的混合菌液配比，并利用该菌液配比作为后续仿刺参养殖试验投菌配比。

1.5.2 菌液安全性试验

为确定试验中的复合微生物净水剂是否符合国家标准，依据中华人民共和国农业行业标准NY/T 1444—2007《微生物饲料添加剂技术通则》[17]中的规定对复合微生物净水剂进行相关的鉴定检测，菌液检测指标包括黄曲霉素B1[18]、志贺氏菌(Shigella)[19]、霉菌总数[20]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[21]、大肠菌群[22]、沙门氏菌(Salmonella)[23]以及砷[24]、汞[25]、镉[26]、铅[27]。具体检测方法以及检测样本量均遵循《微生物饲料添加剂技术通则》[17]的规定进行操作。

1.5.3 仿刺参养殖试验

试验选用大连市瓦房店地区的稚参期仿刺参为试验对象。为让仿刺参适应实验室养殖环境和饵料，试验前对仿刺参进行预饲养7 d，选取规格相近的仿刺参均分至每缸中，每缸饲养约40头，并满足每缸养殖所需海水45 L，每头仿刺参体质量(5±1.32) g，每日17：00时对仿刺参饲喂饵料1次，试验期间缸内持续通入空气，且保证水中溶解氧水平不低于6 mg/L，维持水温在14～16 ℃。仿刺参养殖试验期间，对复合菌剂在不同pH和盐度条件下对养殖水体中氨氮、硫化物以及化学需氧量增长幅度的控制效果进行测量分析。养殖过程中试验组以光合细菌与芽孢杆菌2∶1混合密度配比投放，并分别在不同pH梯度(7.0、7.5、8.0、8.5)和盐度梯度(25、30、35)条件下进行试验，空白对照组只投放基础饵料，不加菌液，每组设3个平行。预饲7 d后，调整梯度再投加菌液不换水，喂养14 d(菌剂量为105cfu/cm3)，测量每组水体样本中氨氮、硫化物质量浓度以及化学需氧量的变化情况，检测方法与1.5.1中对人工污水中化学需氧量、氨氮、硫化物指标的检测方法相同。

1.5.4 生长参数测定

筛选规格相近的仿刺参样本进行分组养殖试验，养殖方式同1.5.3。其中对照组仅饲喂饵料，试验组除饲喂饵料外投放光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1混合密度比例为2∶1的复合微生物净水剂。养殖过程中水体条件满足pH 8.0、盐度35，且每组各设3个平行，每缸仿刺参样本30头。对照组仿刺参初始体质量为(5.02±1.10) g，试验组初始体质量为(4.99±0.97) g，养殖周期为14 d，记录各组仿刺参体质量变化情况。质量增加(m，g)及特定生长率(RSG，%/d)按下式计算：

m=mt-m0

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，mt为仿刺参终末体质量(g)，m0为仿刺参初始体质量(g)，t为时间(d)。

1.5.5 数据分析

试验数据以平均值±标准差表示，并用统计软件SPSS 17.0进行单因素方差分析，不同处理之间采用LDN多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌液混合最优比

本试验测定了不同密度配比混合菌液对人工污水中氨氮、硫化物以及化学需氧量的降解能力。在未接菌的人工污水中，初始氨氮质量浓度为4.68 mg/L，初始硫化物质量浓度为0.62 mg/L，初始化学需氧量为4.02 mg/L(图1)。在测量周期结束后，经测量得出当光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1复合菌液密度配比为1∶1时，人工污水氨氮质量浓度降至(0.54±0.15) mg/L，硫化物质量浓度降至(0.31±0.06) mg/L，化学需氧量降至(2.56±0.42) mg/L；当光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1复合菌液的密度配比为1∶2时，人工污水中氨氮质量浓度降至(0.59±0.33) mg/L，硫化物质量浓度降至(0.20±0.13) mg/L，化学需氧量降至(2.99±0.09) mg/L；当光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1复合菌液密度配比为2∶1时，最终人工污水中氨氮质量浓度降至(0.39±0.15) mg/L，硫化物质量浓度降至(0.26±0.05) mg/L，化学需氧量降至(2.35±0.37) mg/L。由图1可见，3种比例的复合微生态净水剂对氨氮、硫化物、化学需氧量均有一定程度的降解能力，其中对氨氮的降解效果更明显，且混合密度配比为2∶1时，最终氨氮质量浓度相对较低，但三者差异不显著(P>0.05)。对硫化物的降解能力的测量结果显示，在投入复合微生态菌剂0～5 d时，硫化物质量浓度下降明显；而自第7天起，硫化物质量浓度有所增加；根据测量数据得出，当复合菌剂密度配比为2∶1时，硫化物下降较多，但三者差异不显著(P>0.05)。在对化学需氧量降解能力的测量结果显示，在投入3种不同配比的复合菌剂的第5天开始，化学需氧量的变化较为明显，光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1的混合密度比例为2∶1时下降显著(P<0.05)。通过对混合菌液最优配比的测定试验得知，光合细菌PSB1与芽孢杆菌BS1混合密度配比为2∶1时净水效果较为理想。

图1 人工污水中氨氮、硫化物质量浓度和化学需氧量变化Fig.1 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in artificial wastewater

2.2 复合微生物净水剂安全性

根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 1444—2007《微生物饲料添加剂技术通则》[17]对复合微生物净水剂进行相关指标检测，检测结果见表1。试验中对复合微生态制剂的安全性作出评估，所检测的10个卫生指标均符合标准。

表1 菌剂安全性指标Tab.1 Safety index of the microbial water purifier

结果显示，在复合微生物净水剂中检测出含有砷、镉2种成分，其中砷含量为0.017 mg/kg、镉含量为1.634×10-4mg/kg，检测结果均低于国家标准中规定的指标含量，除此以外的其余检测项目均未在复合微生物菌剂中检出。由此得出，本试验提出的光合细菌与芽孢杆菌的复合微生物净水剂符合NY/T 1444—2007《微生物饲料添加剂技术通则》[17]中的规定。

2.3 复合微生物净水剂适用pH和盐度范围

测定在相同盐度不同pH条件的仿刺参养殖水体中氨氮、硫化物和化学需氧量的质量浓度变化情况，结果见图2，仿刺参养殖水体的初始氨氮质量浓度为1.3×10-4mg/L，硫化物质量浓度为2.57×10-3mg/L，化学需氧量为2.35 mg/L。投放混合菌液后，pH 8.5的试验组氨氮质量浓度的上升幅度与对照组无显著差异，而其他试验组数据显示较为平稳，上升幅度不显著，抑制氨氮质量浓度升高的能力较强(P<0.05)。此外，试验组的硫化物质量浓度上升幅度均比对照组低。第8天时，试验组的硫化物质量浓度均显著低于对照组(P<0.05)，但第10天时，pH 8.0和pH 8.5试验组硫化物质量浓度升高较明显。各组化学需氧量均呈升高趋势，而pH 7.5时混合菌液对化学需氧量增长幅度的抑制作用显著(P<0.05)，且显著低于对照组。

图2 不同pH养殖水体中氨氮、硫化物质量浓度和化学需氧量变化Fig.2 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in aquaculture effluent with different pH

在相同pH条件下，3种不同盐度梯度(25、30、35)的仿刺参养殖水体中氨氮、硫化物、化学需氧量的含量变化情况见图3，3个试验组的氨氮质量浓度均明显低于对照组。所有试验组与对照组中，随时间变化氨氮质量浓度均呈持续升高趋势，且在前4 d氨氮质量浓度差异不显著(P>0.05)，但第6天之后，各试验组中氨氮质量浓度上升缓慢，且在盐度为35的试验组中氨氮质量浓度上升幅度最小。

图3 不同盐度养殖水体中氨氮、硫化物质量浓度和化学需氧量变化Fig.3 The changes in levels of ammonia nitrogen, sulfide and COD in aquaculture water with different salinities

养殖水体硫化物检测结果显示，未投放菌剂的对照组硫化物质量浓度不断升高，3个不同盐度的试验组在2～6 d内控制硫化物的能力较强，盐度35试验组中硫化物质量浓度上升幅度最小(P<0.05)。投放复合微生物净水剂后，对照组和盐度25试验组化学需氧量升高幅度较大，而盐度35试验组的化学需氧量增加程度最为平缓，且自第3天起，该复合微生物净水剂控制化学需氧量上升的效果最显著(P<0.05)。

综上所述，通过在不同pH和盐度条件下对仿刺参养殖水体投放本试验中的复合菌剂并与对照组进行对比，可以得出，本试验中的复合微生物净水剂能对养殖水体中氨氮、硫化物质量浓度和化学

需氧量起到一定的控制作用。该复合微生物净水剂适用范围较宽，在不同的海水pH和盐度下，均能起到较好的降解作用，从而对仿刺参养殖水体有很好的净化作用。

2.4 复合微生物净水剂对仿刺参生长性能的影响

养殖试验结束后，对各组仿刺参体质量进行称量，并计算各组仿刺参的质量增加及特定生长率，结果见表2，复合微生物净水剂处理组仿刺参质量增加和特定生长率均显著高于对照组。可以看出，该复合微生物菌剂不仅具有净化水质的效果，还对仿刺参生长有一定促进作用。

表2 复合微生物净水剂对仿刺参生长性能的影响Tab.2 Effect of compound microbial water purification agent on thegrowth performance of the sea cucumber A. japonicus

3 讨 论

3.1 复合微生物净水剂净化养殖水体作用机制

本试验中复合微生物净水剂是光合细菌与芽孢杆菌的混合物，二者的单一型净水剂均在水产养殖中得到应用。光合细菌具有消除污染、净化水体的作用；其在养殖水体内，可利用硫化氢或小分子有机物作为供氢体，同时也能将小分子有机物作为碳源，以含氮化合物、氨基酸等作为氮源利用。因此将其施放在养殖水体后可迅速消除氨氮、硫化氢和有机酸等有害物质，改善水体水质[28]。芽孢杆菌具有多种胞外氧化酶系，能降解水中有机废物，迅速矿化为无机物，特别是能将一些大分子有机物降解为小分子，从而被光合细菌等仅能利用小分子糖类的微生物所利用，有效促进养殖水体的良性循环[29]；此外，芽孢杆菌还可以与养殖环境中的有害藻类及水产致病菌竞争，形成优势种群，抑制有害藻类及水产致病菌[30-31]。本试验充分利用光合细菌与芽孢杆菌具有净水能力的特点，对在不同条件下两种菌株配制的复合微生物净水剂的净水能力进行对比分析，得到实验室制备的光合细菌与芽孢杆菌复合微生物净水剂的最佳混合配比，以及理想的净水条件，使复合菌剂净水效果最大化。

3.2 复合微生物净水剂使用条件的优化

有研究表明，光合细菌与芽孢杆菌协同净化作用明显[32]；姜海明等[33]认为，光合细菌和芽孢杆菌混合后可对乌鳢(Channaargus)养殖水体起到较好的净化作用；李君华等[34]认为，二者以一定比例混合可提高仿刺参的免疫能力。以上研究均表明，光合细菌与芽孢杆菌混合使用净水效果均优于单独使用。但不同复合微生物菌剂净水效果最佳的使用条件各有差异，因此寻找出这两种菌最佳混合配比，对其适合的使用条件进行研究，并对该复合微生物净水剂进行产品品质检测，可以获得该净水剂的实际净水能力，以判断其是否符合作为微生物净水产品的标准。

通过人工污水试验证明，光合细菌与芽孢杆菌按照2∶1密度配比配制时其净水效果最佳。在验证其对人工污水中氨氮、硫化物以及化学需氧量有明显的降解能力后，进行仿刺参养殖试验，对不同条件下的复合菌剂净水效果进行进一步探究。试验结果表明，该复合微生物净水剂在仿刺参喂养期间，对水体中不断增加的氨氮、硫化物、化学需氧量均具有一定的降解作用，从而起到对水质的净化作用。此外，复合微生物净水剂在水体盐度25～35时对水中氨氮、硫化物、化学需氧量均有一定的去除效果，而在pH 7.0～8.5时，复合微生物净水剂对仿刺参养殖水体中氨氮、硫化物和化学需氧量去除效果较为理想。通过对中华人民共和国农业行业标准NY/T 1444—2007《微生物饲料添加剂技术通则》[17]规定的复合微生物净水剂相关指标进行检测，证明本试验中的复合微生物净水剂产品满足作为微生物饲料添加剂行业标准。因此，本微生物净水剂适用于多种海水养殖环境，对仿刺参等海产品的绿色养殖和水体环境净化有重要作用。

4 结 论

笔者开发了光合细菌与芽孢杆菌按照密度配比2∶1配制的复合微生物净水剂，在验证其对人工污水中氨氮、硫化物以及化学需氧量有显著的降解能力后，将其应用于仿刺参养殖中。试验结果表明，该复合微生物净水剂在仿刺参喂养期间对水体中不断增加的氨氮、硫化物、化学需氧量具有一定的降解作用，从而起到水质的净化作用。此外，在水体pH 7.0～8.5，盐度25～35时，复合微生物净水剂对氨氮、硫化物和化学需氧量均有较好的降解作用。检测养殖期间仿刺参生长性能指标发现，该净水剂对仿刺参生长有一定促进效果。