谢永丽，汤华

（天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津 300070）

肝细胞癌（HCC）是人类主要恶性肿瘤之一，死亡率排名全球第4位。而乙型肝炎病毒（HBV）感染是引发HCC的主要危险因素，占全球HCC病例的一半以上。因此，迫切需要更好地了解HBV导致HCC的分子机制以及找到新型治疗靶点。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中发生的最丰富的修饰。研究表明，m6A在病毒和疾病发生、发展过程中起重要作用。虽然YTHDF1（YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1）已经被报道与卵巢癌抗癌免疫疗法[1]和海马依赖性学习及记忆[2]等有关，但其在HBV相关肝癌中的作用研究尚少。

本研究通过分子克隆机制构建了过表达和敲降YTHDF1质粒，探讨YTHDF1对HBV编码蛋白表达的影响和对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人正常肝细胞L02、肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15细胞，均购买自ATCC细胞库，并为本实验室液氮保存。胎牛血清（FBS）、DMEM、MEM-α培养基、Opti-MEM培养基均购自美国GIBCO BRL。Lipofectamine2000购自Invitrogen。所有抗体、cDNA均购自中国天津赛尔生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养L02细胞、Huh7细胞用含有10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素以及100 IU/mL青霉素的DMEM培养基培养。HepG2.2.15细胞用含有15%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺以及200 μg/mL G 418的MEM-α培养基培养。上述细胞均培养在含5%CO2、37℃的细胞培养箱中。

1.2.2 过表达YTHDF1质粒的构建 用YTHDF1 cDNA作为模板进行PCR，PCR循环体系如下：预变性95℃4 min；变性94℃1 min，退火55℃30 s，延伸72℃2 min，进行“变性-退火-延伸”循环33次；延伸72℃10 min。回收大小约为1.67 kb的PCR产物。对pCD3/Flag-KBE质粒和PCR产物进行酶切，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ,回收大小约为5.6kb和1.67 kb酶切产物。然后连接，铺板，小提鉴定，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ，将条带正确的质粒送测序。

1.2.3 敲降YTHDF1质粒的构建 首先针对YTHDF1 mRNA设计合……